珊瑚狀猴頭菌多糖對大鼠肝抗氧化及代謝調節*

唐 鵬，李學英，王大忠，馮翠萍，韓愛麗

(1.遵義醫學院細胞生物學與遺傳學教研室，貴州 遵義 563003；2.山西農業大學食品科學與工程學院，山西 晉中 030801)

珊瑚狀猴頭菌多糖對大鼠肝抗氧化及代謝調節*

唐 鵬1，李學英1，王大忠1，馮翠萍2**，韓愛麗2

(1.遵義醫學院細胞生物學與遺傳學教研室，貴州 遵義 563003；2.山西農業大學食品科學與工程學院，山西 晉中 030801)

探討珊瑚狀猴頭菌多糖的抗氧化作用和對大鼠肝臟代謝的相關基因表達的影響。將大鼠隨機分為正常對照組、多糖干預組和模型組。對照組喂飼基礎飼料，多糖干預組(劑量1組、劑量2組)和模型組喂飼高膽固醇飼料，同時多糖干預組(劑量1組、劑量2組)給予多糖灌胃5周，5周后處死大鼠取肝臟。分別測定大鼠肝臟的丙二醛(MDA)含量，總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶 (CAT)的活力。使用實時熒光定量PCR分別檢測大鼠肝臟相關基因表達量：酰輔酶A：膽固醇酰基轉移酶2(ACAT2)、卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(LCAT)。與模型組比較：多糖劑量1組、劑量2組大鼠肝臟的MDA含量顯著下降(p<0.01)，T-SOD活力顯著升高(p<0.01)，GSH-Px活力顯著升高(p<0.01)，CAT活力顯著提高(p<0.01)；多糖劑量1組、多糖劑量2組大鼠肝臟的基因表達量ACAT2 mRNA顯著下降(p<0.01)；LCAT mRNA顯著升高(p<0.01)。珊瑚狀猴頭菌多糖具有顯著的抗氧化作用，對大鼠肝臟的代謝具有調節作用。

珊瑚狀猴頭菌；多糖；膽固醇；基因表達；抗氧化性；代謝；肝臟

食用菌集各種營養于一身，是當前人類最有發展前途、最具希望的健康食品。活性多糖的最佳種類來自真菌多糖，其廣泛的生物活性已逐漸被人們認知。食用菌多糖是功效十分顯著的生物活性物質，是食藥兼用菌中所含的最重要的藥效成分，在國內外被稱為“生物反應調節劑”。隨著人們生活水平的提高，健康保健意識逐漸增強，作為藥食同源的食用菌，其多糖的研究日益受到研究者關注。

真菌多糖是1種從真菌中提取獲得的安全無毒的天然高分子聚合物[1]。目前已經開展了靈芝、茶樹菇、猴頭菇等食用菌多糖抗氧化活性及耐缺氧功能的研究。我國是最早栽培和利用食用菌的國家之一，資源非常豐富。大量的研究表明，食用菌的生物活性主要來自其多糖和多糖肽類，食用菌多糖能明顯降低心肌組織的脂褐質含量，增強體內SOD酶(超氧化物歧化酶)活力，從而清除體內氧自由基等有害物質，具有良好的清除自由基功效，達到延緩衰老的效果[2]。隨著一系列新型的、安全高效的真菌多糖藥物和保健品迅速進入市場，毒副作用小、效率高的食用菌多糖越來越受到人們的重視。

高脂血癥的發病率逐年升高，究其原因，脂質代謝異常是導致高血脂的直接原因，如何預防和治療高膽固醇血癥成為當前研究的重要課題。肝臟是合成脂肪酸和脂肪的主要場所，也是人體中合成膽固醇最旺盛的臟器，是血漿膽固醇的主要來源。此外，肝臟還合成并分泌卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(LCAT)，促使膽固醇酯化。膽固醇生物合成的原料是乙酰輔酶A，膽固醇的分解代謝也在肝臟內進行。膽固醇在體內有著廣泛的生理作用，但當其動態平衡遭到破壞，膽固醇過量會導致高膽固醇血癥，脂質代謝失調。高膽固醇是導致動脈粥樣硬化(AS)的主要危險因素之一，血漿膽固醇含量與冠心病及心肌梗塞的發生率呈正相關[3]。近年來有研究表明靈芝、香菇、黑木耳、猴頭菇等食用菌多糖具有防治高血糖、高血脂的作用，紅菇多糖能顯著降低糖尿病小鼠的血糖值，同時甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇顯著降低[4]。金耳多糖可以顯著降低鏈脲霉素所致糖尿病小鼠血液中總膽固醇(TC)含量，其機理可能是多糖抑制了總膽固醇(TC)的吸收[5]。

猴頭菌屬多糖具有抗腫瘤、提高免疫力、抗凝血、降血脂等功效[6]，但目前關于珊瑚狀猴頭菌(Hericiumcoralloides)多糖的抗氧化作用研究鮮見報道,對大鼠肝臟ACAT2、LCAT影響的研究尚未見報道。因此，本實驗利用珊瑚狀猴頭菌提取了水溶性好、安全無毒副作用的多糖，對多糖進行抗氧化及大鼠肝臟代謝調節的作用研究，旨在為珊瑚狀猴頭菌來源的新型高效多糖制劑研發及其深度開發利用提供可借鑒的技術資料。

1 材料和儀器

1.1 材料

受試動物及分組SD雄性大鼠，32只，體重(100±10)g, 清潔級，山西醫科大學實驗動物中心提供。隨機分為正常對照組、多糖干預組(劑量1組、2組)和模型組4個組。

1.2 飼養條件

基礎飼料、高膽固醇飼料由山西醫科大學實驗動物中心提供。飼養條件符合標準[室溫(24±1)℃，相對濕度(55±10)%，12 h避光，每籠4只，自由飲水進食，每天清洗飲水瓶、添加飼料，及時清除霉變和污染飼料等，適應性喂養1周后，正常組喂飼基礎飼料，其它各組喂飼高膽固醇飼料]。

1.3 主要儀器

FA1204B型電子分析天平(北京)；RE-52C型旋轉蒸發器(上海)；BS210S型電子天平(北京)；DL-1型電子萬用爐(天津)；TGL-16G型臺式離心機(上海)；TDA-8002型電熱恒溫水浴鍋(北京)；XW-80A型漩渦混合器(上海)；751G型可見光分光光度計(上海)；BSC-1000 II A2型生物安全柜(北京)；高速電動勻漿機(天津)；數顯電熱恒溫烘箱(北京)；標準型pH計(德國)；凝膠成像系統(意大利)；可調式微量移液槍(德國)；Y96000型電子分析天平(上海)；ABI9700型普通PCR儀(美國)；5804R型冷凍離心機(德國)；DZKW-D-1型電熱恒溫水浴鍋(北京)；Mx3000P型實時熒光定量PCR儀(美國)；BIO safe 12型生物安全柜(北京)；核酸蛋白測定儀(德國)；超低溫冰箱(日本)；透析袋(上海)；冷凍干燥機(北京)。

1.4 主要試劑

超氧化物歧化酶SOD(Superoxide Dismutase)試劑盒、丙二醛MDA(Maleic Dialdehyde)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px測定試劑盒、CAT(Catalase)試劑盒、考馬斯亮蘭試劑盒，試劑盒均為南京建成生物工程有限公司產品；RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)試劑盒、SYBR(r) Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)試劑盒、PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒，均為大連寶生公司產品；DEPC，加拿大BIO BASIC INC公司；PCR引物合成，上海生工生物工程技術服務有限公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、濃硫酸、葡萄糖常用試劑均為國產分析純。

1.5 原料

珊瑚狀猴頭菌粉：山西農業大學食用菌中心提供。

2 方法

2.1 珊瑚狀猴頭菌多糖提取流程

珊瑚狀猴頭菌粉→熱水浸提→過濾→離心(棄去殘渣，留上清液)→乙醇沉淀 → 離心(棄去上清液)→(丙酮、乙醚)脫脂→透析→冷凍干燥→珊瑚狀猴頭菌多糖。

稱取珊瑚狀猴頭菌干粉適量，以1∶40的料水比加蒸餾水，90℃恒溫水浴浸提3 h；濾紙過濾；離心取上清液( 4 000 r·min-1，10 min)，濃縮，重復浸提1次然后加入4倍體積的乙醇，靜置過夜。再進行離心，所得沉淀依次用丙酮、乙醚洗滌3次，烘干至質量恒定，取其適量用蒸餾水充分溶解，溶液置于透析袋中，用自來水淋洗48 h，再用蒸餾水透析24 h，然后用3倍體積的無水乙醇沉淀多糖，靜置過夜， 4 000 r·min-1離心10 min后取沉淀，冷凍干燥至質量恒定，即為含糖量為75.28%的珊瑚狀猴頭菌多糖。以備實驗使用。

2.2 給藥方式

實驗將大鼠隨機分為正常對照組、多糖劑量1組(200 mg·kg-1)、多糖劑量2組(100 mg·kg-1)、模型組共4個組，每組8只大鼠；多糖干預組給藥：根據大鼠體重將珊瑚狀猴頭菌多糖溶液按設定的劑量每天定時給大鼠灌胃1mL，同時對照組和模型組大鼠用生理鹽水灌胃1mL；動物連續給藥5周后，于末次給藥12 h后處死大鼠并取其肝臟。

2.3 珊瑚狀猴頭菌多糖抗氧化作用研究

各組大鼠取肝臟200 mg進行勻漿，離心、沉淀，用于SOD、CAT、MDA、GSH-Px的測定，測定方法按照試劑盒說明書進行。

2.4 Real time PCR檢測ACAT2 mRNA和LCAT mRNA的表達量

依試劑盒說明書,采用Trizol試劑盒提取肝臟總RNA；Taq-ManReverse Transcription Reagents試劑盒逆轉錄成cDNA；SYBRGreenPCRMasterMixreagentkits試劑盒進行擴增，其mRNA相對表達量采用2-ΔΔCt相對定量法[7]。

大鼠β-actin、LCAT、ACAT2 mRNA序列來源 (Gene Bank)，應用Primer5plμs引物設計平臺設計試驗引物，深圳華大基因有限公司合成。其引物序列、產物大小及位置見表1。

表1 引物序列、產物大小及位置

2.5 統計學處理

3 結果

大鼠肝臟SOD、CAT、MDA、GSH-Px含量的測定結果見表2。

與正常對照組相比,模型組大鼠肝臟的SOD、CAT、GSH-Px活力顯著降低(p<0.01)，MDA含量顯著升高(p<0.01)。與模型組相比，劑量1組、劑量2組大鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px活力顯著升高，MDA含量顯著下降(p<0.01)。

大鼠肝臟的基因表達檢測結果見表3。

由表3可以看出，模型組和對照組相比，大鼠肝臟ACAT2 mRNA的表達量顯著升高(p<0.01)；肝臟LCAT mRNA的表達量顯著降低(p<0.01)。珊瑚狀猴頭菌多糖可下調ACAT2 mRNA的表達，劑量1組、劑量2組與模型組相比有顯著差異(p<0.01)。珊瑚狀猴頭菌多糖可上調LCAT mRNA的表達，劑量1組和劑量2組與模型組相比有顯著差異(p<0.01)。

表2 大鼠肝臟抗氧化能力測定結果

注：劑量1、劑量2組與模型組相比，*p<0.01，#p<0.05；模型組與對照組相比，*p<0.01，#p<0.05。

表3 大鼠肝臟ACAT2mRNA和 LCATmRNA相對表達量

注：劑量1、劑量2組與模型組相比，*p<0.01，#p<0.05；模型組與對照組相比，*p<0.01，#p<0.05。

4 討論

在食藥用真菌類發現的抗氧化活性物質，為氧化損傷相關疾病的治療帶來了新的希望，成為研發安全高效天然抗氧化劑值得關注的新途徑。目前已經在靈芝、茶樹菇、猴頭菇等食用菌中展開了其多糖抗氧化活性及耐缺氧功能的研究。有文獻報道，香菇、靈芝、猴頭菇等食用菌多糖能夠清除超氧自由基、DPPH、羥基自由基等自由基對人體的傷害，具有極強的抗氧化活性[8]。猴頭菌絲多糖能明顯提高小鼠血清、大腦、肝臟中SOD、CAT的含量，明顯降低小鼠大腦、肝臟MDA水平，具有重要的抗氧化、延緩衰老功能[9]。

食用菌類多糖具有重要的生物學功能，具有抗氧化等多種生物活性。本實驗對于珊瑚狀猴頭菌多糖的抗氧化及對大鼠肝臟代謝調節作用進行了研究。過量的自由基(Free radical)可對生物大分子、細胞器、細胞等造成累積性氧化損傷，導致組織損傷和器官功能衰退，誘導及加速機體衰老。動脈粥樣硬化的發生與脂質過氧化損傷有關[10]。膽固醇、甘油三酯過高及血管壁上過多的脂類容易被自由基氧化，形成脂質過氧化物質在血管壁沉積，導致動脈粥樣硬化(AS)[11]。多糖可通過提高SOD、CAT、GSH-Px等酶的活力從而發揮抗氧化的作用[12]。

LCAT能夠抑制LDL氧化過程中的負電荷增加，防止在脂蛋白氧化過程中脂質被氧化。實驗表明多糖可顯著提高機體內LCAT活性，加速體內過剩膽固醇的清除。還可以顯著提高機體內GSH-Px和SOD活力，抑制MDA升高，體內在SOD、CAT和GSH-Px的共同作用下清除超氧陰離子、羥自由基及過氧化氫，減輕或阻斷過氧化物損傷。可能阻止HDL被氧化，從而保證體內過剩的膽固醇順利排出。膽固醇酯分子較大，難以透過細胞膜，因此易被HDL分子運至肝臟清除[13]。

LCAT的活性有利于膽固醇的清除，可將細胞外高密度脂蛋白(HDL)的游離膽固醇酯化，高密度脂蛋白主要功能是將外圍組織和血液中的膽固醇運送至肝臟進行代謝，被稱為清道夫，具有抗動脈粥樣硬化的作用[14]。研究發現高膽固醇喂飼對大鼠肝臟LCATmRNA、ACAT2mRNA的表達有顯著影響。本實驗首次發現珊瑚狀猴頭菌多糖對于大鼠肝臟卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(LCAT)有調節作用，LCAT活性提高，可促使HDL2-C合成將外周組織的游離膽固醇轉移至肝臟代謝。且LCAT的活性直接影響到機體內過剩膽固醇的清除速度。實驗同時還發現，珊瑚狀猴頭菌多糖可以有效下調肝臟細胞內膽固醇酯化關鍵酶ACAT2mRNA的表達。

膽固醇酯化家族主要包括 ACAT1、ACAT2和LCAT[15]。ACAT2只在肝臟和小腸上皮細胞中表達，主要參與膽固醇的吸收和脂蛋白的裝配。ACAT2是1種可被誘導表達的酶，主要分布于小腸上皮細絨毛頂端和肝臟細胞內，催化膽固醇與長鏈脂肪酸連接形成膽固醇酯。成年人的肝臟正常情況下ACAT2活性較低，ACAT2的作用是保護肝細胞免受過剩膽固醇的損害。ACAT2催化膽固醇酯合成主要與膽固醇吸收及乳糜微粒的合成有關， ACAT2在肝細胞中所提供的膽固醇酯與脂蛋白分泌有關[16]。ACAT2低活性對機體具有保護作用。有文獻報道，ACAT2水平的調節對于脂質代謝非常重要，ACAT2被視為高膽固醇血癥的一個重要靶標[17]。特異性抑制ACAT2，能有效地降低細胞內膽固醇酯的含量，且不會影響動物的正常生理功能。可阻止小腸對膽固醇的吸收和肝臟對膽固醇的酯化，降低血漿中膽固醇水平，預防和治療AS。低密度脂蛋白被視為AS的主要危險因素，ACAT2具有調節膽固醇代謝及VLDL合成分泌作用[18]。

綜上所述，珊瑚狀猴頭菌作為食品功能因子，是一種應用前景廣闊的真菌，具有極為重要的醫療、營養保健等應用價值。體內膽固醇代謝異常是導致心血管疾病發生發展的重要原因之一，本實驗表明，珊瑚狀猴頭菌多糖具有抗氧化作用，通過下調大鼠肝臟的ACAT2mRNA的表達和上調LCATmRNA的表達而具有顯著的代謝調節作用，加上食用菌多糖幾乎無毒副作用的特點，因此，珊瑚狀猴頭菌多糖也是一種新型高效安全的天然多糖制劑，可廣泛應用于醫藥和保健食品的研制。

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Effect on Antioxidant and Regulation of Hepatic Metabolism in Rats ofHericiumcoralloidesPolysaccharide

TANG Peng1, LI Xue-ying1, WANG Da-zhong1, FENG Cui-ping2, HAN Ai-li2

(1.Zunyi Medical University, Department of Cell Biology and Genetics, ZunyiGuizhou563003; 2.Shanxi Agricultural University, College of Food Science and Engineering, JinzhongShanxi030801)

The effect of antioxidant and the expression of related genes in rat liver metabolism ofHericiumcoralloidespolysaccharide were explored. The rats were randomly divided into control group, intervention group and control group of polysaccharides. The control group was fed with basic feed, polysaccharide intervention group (dose group 1, dose group 2) and model group fed with high cholesterol diet, and polysaccharide intervention group (dose group 1, dose group 2) gave polysaccharide orally for 5 weeks, the rats were killed after 5 weeks of livers. Rat liver MDA content, superoxide dismutase (T-SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) activity were measured. Real-time fluorescence quantitative PCR were used to detect the gene expression related to rat liver index: A acetyl CoA: cholesterol acyltransferase2 (ACAT2), lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT). The results showed that compared with the model group, polysaccharide dose group 1 and group 2 doses of MDA content significantly decreased in rat liver(p<0.01), T-SOD activity increased significantly (p<0.01), GSH-Px activity increased significantly (p<0.01), and CAT activity was significantly improved (p<0.01). Liver gene expression index of polysaccharide dose group 1 and group 2, ACAT2 mRNA decreased significantly(p<0.01), and LCAT mRNA increased significantly (p<0.01). TheHericiumcoralloidespolysaccharide had significant antioxidant effect, which had regulatory effect on metabolism in rat liver.

Hericiumcoralloides; Polysaccharides; Cholesterol; Gene expression; Antioxidant capacity; Metabolism; Liver

*項目來源：山西省自然科學基金項目“姬松茸多糖對鉛中毒大鼠免疫調節機理的研究”(2010011043-1)；山西省科技攻關項目“珍稀菇類姬松茸、茶薪菇、靈芝的研究開發和利用”(021025)。

唐鵬(1987-)，男，在讀碩士研究生，主要從事生物藥效學研究。E-mail：tpweb@126.com

**通信作者： 馮翠萍，教授，主要從事食品營養與安全研究。E-mail：ndfcp@163.com

2014-03-25

S646.9

A

1003-8310(2014)03-0048-04