淫羊藿內(nèi)生真菌的分離及抑菌活性研究

易萌等

摘要：從淫羊藿根、莖、葉分離出23株內(nèi)生真菌，對(duì)分離出的真菌利用瓊脂塊法進(jìn)行初選與濾紙片法進(jìn)行復(fù)選，并以金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、灰霉病菌（Botrytis cinerea） 4 種微生物為指示菌對(duì)分離到的內(nèi)生真菌進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離得到的內(nèi)生真菌中有10株菌株具較好的抑菌活性。對(duì)大腸埃希菌抑菌效果最好的為標(biāo)號(hào)K7的菌株，抑菌圈直徑為18.0 mm；對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果最好的均為標(biāo)號(hào)B3的菌株，其抑菌圈直徑分別為18.0、15.0 mm；而對(duì)灰霉病菌抑菌效果最好的為標(biāo)號(hào)K6的菌株，其抑菌圈直徑達(dá)到12.0 mm。

關(guān)鍵詞：淫羊藿；內(nèi)生真菌；抑菌活性

中圖分類(lèi)號(hào)：S482.2+92；Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0327-03

淫羊藿，為小檗科植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鮮淫羊藿等多種淫羊藿的莖葉[1]，主產(chǎn)于貴州、遼寧等省[2-3]，夏、秋季采收，割取莖葉，除去雜質(zhì)，曬干。淫羊藿莖葉含有淫羊藿苷和揮發(fā)油。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為淫羊藿性味辛甘、溫，有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)除濕的功效；同時(shí)，淫羊藿還可以抑制血管運(yùn)動(dòng)中樞，擴(kuò)張周?chē)埽寡獕合陆担瑢?duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒、白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌等有顯著的抑制作用。淫羊藿在臨床上主要用于治療生殖、骨關(guān)節(jié)、呼吸系統(tǒng)疾病[4-5]。

植物內(nèi)生真菌（endophyte fungus）是指在健康植物寄生的、在各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙中進(jìn)行部分或全部生活周期而不使宿主表現(xiàn)明顯病理癥狀的一類(lèi)真菌[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌普遍存在于植物組織內(nèi)，并和宿主植物長(zhǎng)期共生，與宿主在遺傳、生理、代謝等方面相互滲透、同步進(jìn)化，形成互利互惠的共生關(guān)系，使得它極有可能與宿主交換遺傳信息，從而產(chǎn)生相似或相同生理活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物[7]。1993年Stierle等從短葉紅豆杉內(nèi)生真菌中分離得到紫杉醇后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從多種藥用植物中陸續(xù)分離得到產(chǎn)生活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌[6，8]，因此具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥用植物內(nèi)生真菌已成為篩選新藥物的潛在資源[9-12]。

本試驗(yàn)以貴州省貴陽(yáng)市郊的野生淫羊藿（Epimedium）為材料進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離，并對(duì)其抗菌活性進(jìn)行初步研究，以獲得產(chǎn)生生物活性次生代謝產(chǎn)物的藥用微生物，進(jìn)而為新型抗菌物質(zhì)的獲得開(kāi)辟一條新路徑。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與內(nèi)生真菌的分離

淫羊藿樣品采自貴州省貴陽(yáng)市郊。采集的新鮮植物樣品4 ℃保存，72 h內(nèi)處理。

1.2 供試指示菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、灰霉病菌（Botrytis cinerea），均由貴州師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 試驗(yàn)流程

淫羊藿內(nèi)生真菌分離及抑菌活性試驗(yàn)流程見(jiàn)圖1。

1.4 內(nèi)生真菌的分離、純化

將采集的新鮮樣品用自來(lái)水洗凈泥土等臟物，根、莖、葉分別切為0.5 cm的小片。在無(wú)菌條件下，對(duì)樣本進(jìn)行表面消毒，具體步驟如下：無(wú)菌水沖3次，Tween-20 處理30 s，8%次氯酸鈉溶液消毒5 min，無(wú)菌水沖洗3 次，75%乙醇浸泡5 min，無(wú)菌水洗滌3次。同樣無(wú)菌條件下將樣本切成0.2 cm×0.2 cm 大小接種于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落，從菌落邊緣取菌絲分別接種于新鮮平板，經(jīng)反復(fù)轉(zhuǎn)接得到純化菌株，保藏待用[13]。

1.5 指示菌的培養(yǎng)

將枯草芽胞桿菌和大腸埃希菌的單菌落接種于5 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，將金黃色葡萄球菌單菌落接種于LB培養(yǎng)基，用無(wú)菌水制備濃度約為 2.2×105 CFU/mL 的菌懸液，灰霉病菌在PDB培養(yǎng)基里 28 ℃ 搖床振蕩3 d，取100 μL 菌懸液接種于PDA固體培養(yǎng)基上，用玻璃環(huán)涂抹，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.6 抗菌活性菌株的初選

采用瓊脂塊法對(duì)所分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行抗菌活性的初選，具體步驟如下：用打孔器從在PDA平板上生長(zhǎng)的菌落上截取直徑為6.0 mm的瓊脂塊，用無(wú)菌鑷子將瓊脂塊放置于涂有指示菌的PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察及測(cè)量抑菌圈直徑[14]，重復(fù)3次。

1.7 抗菌活性菌株的復(fù)選

檢測(cè)活性菌株發(fā)酵液的抑菌活性，作為活性菌株的復(fù)選方法，具體步驟如下：將初選菌株接種于100 mL PDB液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)8 d，4 000 r/min 離心15 min，收集上清，過(guò)濾除菌，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將90 mL發(fā)酵液縮至1 mL。將紙片放在涂有指示菌的PDA平板上，點(diǎn)入20 μL發(fā)酵液在紙片上，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察并測(cè)量抑菌圈的直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 淫羊藿內(nèi)生真菌分離結(jié)果

采用組織分離法從淫羊藿葉、莖、根中共分離得到23株菌落形態(tài)特征有差異的內(nèi)生真菌，其中A類(lèi)菌株有6株，B類(lèi)有10株，K類(lèi)有7株，試驗(yàn)部分菌株形態(tài)見(jiàn)圖2，其生態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定還有待研究。

2.2 淫羊藿內(nèi)生真菌抑菌活性初步測(cè)定

用瓊脂塊法從23株內(nèi)生真菌中初選抗菌活性較強(qiáng)的菌株。結(jié)果表明，A1、A3、A4、B3、B7、B8、K6、K7、K8、K9等10株內(nèi)生真菌對(duì)大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和灰霉病菌均有一定的抑菌活性（表1）。

由表1可知，對(duì)大腸埃希菌抑菌效果最好的是K6、K7，抑菌圈直徑分別達(dá)17.0、18.0 mm，其次是A4、B3、B8，抑菌圈直徑為13.0 mm。B3對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑達(dá)到 18.0 mm，效果最好。對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果顯著的是B3、K7、K6，抑菌圈直徑分別為15.0、14.0、13.0 mm。對(duì)真菌指示菌灰霉病菌而言，K6抑制其生長(zhǎng)的效果最好，抑菌圈直徑為12.0 mm，其次，A3、B3、K7的抑菌效果也很好。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)瓊脂塊法從淫羊藿中篩選得到了具有抗菌活性的A1、A3、A4、B3、B7、B8、K6、K7、K8、K9等10株菌株，測(cè)定了其抑菌直徑，根據(jù)初選試驗(yàn)可以得出結(jié)論：從不同指示菌株來(lái)看，對(duì)大腸埃希菌抑菌效果最好的是K6和K7；對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌效果最好的是B3和K6；對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果最佳的是B3和K7；對(duì)灰霉病菌抑菌效果最好的是K6。對(duì)于內(nèi)生真菌來(lái)說(shuō)，A1對(duì)大腸埃希菌抑菌效果更好；A3對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌效果不錯(cuò)；A4對(duì)大腸埃希菌抑菌效果更佳；B3對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌效果更好；B7和B8、K8和K9對(duì)幾種指示菌的抑菌效果相差不大；K6和K7對(duì)大腸埃希菌抑菌效果更佳。

在復(fù)選活性測(cè)定中有4株菌株具較好的抑菌活性，B3、B8、K9對(duì)灰霉病菌菌株有較強(qiáng)的抑菌活性，B3、B7則對(duì)大腸埃希菌抑菌活性明顯，初步顯示B3菌株有廣譜的抑菌活性。對(duì)初選具抑菌活性的10種菌株的鑒定還有待進(jìn)一步的分子試驗(yàn)。

植物內(nèi)生真菌的特殊生境決定了其具有重要的農(nóng)藥和醫(yī)藥應(yīng)用潛力，而具抗菌、抗腫瘤活性菌株豐富的次生代謝產(chǎn)物已成為藥物來(lái)源新途徑，必將在天然藥物研究中得到開(kāi)發(fā)與利用。試驗(yàn)證實(shí)，淫羊藿植物內(nèi)生真菌豐富，分離的部分內(nèi)生真菌菌株具明顯的抗菌活性，對(duì)其活性成分進(jìn)一步分離、分析，對(duì)新型藥物的篩選具重要意義[15]。

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