高效鎘吸附菌株的篩選及生物學(xué)特性

劉標(biāo)等

摘要：為了獲得高效鎘吸附微生物，從重金屬污染土壤中分離篩選到4株耐鎘能力較強(qiáng)的細(xì)菌菌株2-1、2-2、4-1、7-1，并對(duì)這4株菌株的鎘吸附能力進(jìn)行研究。結(jié)果表明，菌株4-1的吸附效果最好，達(dá)到90.0%，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征鑒定及16S rDNA序列分析結(jié)果，將其鑒定為金黃桿菌。同時(shí)，本研究還分析了通氣量及其他常見重金屬離子對(duì)菌株4-1生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示，500 mL錐形瓶中裝液量為100～150 mL時(shí)，有利于菌株的生長(zhǎng)，培養(yǎng)液中加入Zn2+、Cu2+對(duì)菌株生長(zhǎng)無明顯影響，但加入100 mg/L Pb2+會(huì)抑制其生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：鎘；吸附能力；通氣量；金黃桿菌

中圖分類號(hào)： X172 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0316-03

湖南省株洲市清水塘工業(yè)區(qū)是全國(guó)主要的重化工基地之一，自20世紀(jì)50年代以來，工業(yè)區(qū)的工業(yè)企業(yè)大多超標(biāo)排放“三廢”（廢水、廢氣、廢渣），“三廢”中的重金屬對(duì)周圍土壤、地表水和地下水等環(huán)境造成了嚴(yán)重污染。2006年1月6日湘江鎘污染，造成湖南株洲、湘潭和長(zhǎng)沙段湘江水質(zhì)鎘超標(biāo)，嚴(yán)重威脅人們的身體健康[1]。鎘是一種毒性很強(qiáng)的重金屬元素，鎘離子對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類的毒害引起了世界各國(guó)的高度重視，1974年聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署和國(guó)際勞動(dòng)衛(wèi)生重金屬委員會(huì)就將其定為重點(diǎn)污染物，美國(guó)毒物管理委員會(huì)（ATSDR）也將其列為第6位危及人類健康的毒害物質(zhì)[2]，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)確定為人類和試驗(yàn)動(dòng)物的肺癌和前列腺癌的確認(rèn)致癌物[3]。隨著重金屬污染日趨嚴(yán)重，污染治理已成為備受關(guān)注的焦點(diǎn)。傳統(tǒng)重金屬污染土壤的治理方法主要是物理和化學(xué)法，如工程修復(fù)法（換土法）、活性炭吸附法、離子交換法、化學(xué)沉淀法、氧化還原法等。這些方法雖各有特點(diǎn)，但也有一定的局限性，或是不同程度地存在成本高、選擇性低、能耗高，并可能產(chǎn)生二次污染等問題[4-5]，現(xiàn)正逐漸被生物吸附法所代替。微生物特別是細(xì)菌數(shù)量多、比表面積大、代謝活性旺盛，可通過多種方式對(duì)重金屬進(jìn)行生物吸附[6-8]。生物修復(fù)是頗具潛力的治理方法，從污染土壤中分離篩選的本土微生物能有效提高生物修復(fù)效率。因此，研究本土抗重金屬微生物對(duì)修復(fù)重金屬污染具有重要意義。本試驗(yàn)從株洲市清水塘工業(yè)污染區(qū)采集土壤樣品，并從中篩選到1株鎘吸附能力強(qiáng)的細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行了種屬鑒定，以期獲得修復(fù)重金屬鎘污染的高效菌株，為工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供重要的菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 從株洲清水塘工業(yè)區(qū)采集土壤樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值7.0～7.2，121 ℃高溫滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：20%馬鈴薯煮汁100 mL，葡萄糖2 g，瓊脂1.5～2.0 g，pH值自然，121 ℃高溫滅菌20 min。

1. 2 試驗(yàn)方法

1.2.1 耐鎘微生物的分離及純化 取10 g采集的土樣加入到盛有90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩混勻10 min，采用10倍系列梯度稀釋法進(jìn)行稀釋，然后取0.1 mL 10-6 稀釋液加入到含100、200、400、600、800 mg/L鎘的牛肉膏蛋白胨平板（或PDA平板）中，涂布均勻，倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中。以不加鎘的培養(yǎng)基為對(duì)照，將各培養(yǎng)基上獲得的單菌落利用平板劃線法獲得純培養(yǎng)。

1.2.2 耐鎘微生物對(duì)鎘的吸附能力 將所獲得的4株耐鎘菌株菌懸液1 mL（濃度約為1億CFU/mL）分別培養(yǎng)于含鎘[CdCl2·2.5H2O]濃度為100 mg/L的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃下振蕩培養(yǎng)72 h，設(shè)3個(gè)重復(fù)，以接種等量無菌水的處理為對(duì)照。培養(yǎng)后，各菌株菌懸液5 000 r/min離心 15 min，取上清液備用，對(duì)照采用同樣方法進(jìn)行處理。利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測(cè)定各處理上清液中鎘的濃度。各菌株對(duì)培養(yǎng)液中鎘的吸附率=（C0-Ct）/C0×100%。其中，C0為對(duì)照上清液中鎘的濃度（mg/L）；Ct為吸附后的上清液中鎘的濃度（mg/L）。

1.2.3 高效鎘吸附菌株4-1的菌種鑒定

1.2.3.1 菌株4-1的形態(tài)特征和生理生化試驗(yàn) 觀察菌株4-1的菌落形態(tài)特征，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌進(jìn)行簡(jiǎn)單染色、革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)特征。參照文獻(xiàn)[9]，對(duì)菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

1.2.3.2 細(xì)菌16S rDNA序列鑒定 將細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用DNA提取試劑盒提取細(xì)菌的基因組DNA，PCR擴(kuò)增采用16S rDNA通用引物：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃終止。將PCR產(chǎn)物利用回收試劑盒純化后交由上海生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)得的序列通過美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）比對(duì)分析，利用Clustal X 和Phylip軟件構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 通氣量對(duì)菌株4-1生長(zhǎng)的影響 在500 mL的搖瓶中分別裝入50、100、150、200、250 mL的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，按體積比為1%的接種量接入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4-1菌液。30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后，測(cè)定菌液在600 nm處的吸光度。

1.2.5 其他重金屬離子對(duì)菌株4-1生長(zhǎng)的影響 在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中分別加入Cu2+、Zn2+、Pb2+，使這些離子的終濃度為100 mg/L，按體積比為1%的接種量接入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4-1菌液。于30 ℃下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，再測(cè)定菌液在 600 nm 處的吸光度。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鎘微生物的分離純化

在30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)2、7 d，在不含鎘的平板上共分離純化得到22株優(yōu)勢(shì)菌株，其中細(xì)菌菌株21株，霉菌菌株1株。在含鎘濃度為100 mg/L的平板上有14株菌株生長(zhǎng)較好；當(dāng)鎘濃度提高到800 mg/L時(shí)，仍有4株菌株可以生長(zhǎng)，結(jié)果如表1所示。

2.5 重金屬離子對(duì)菌株 4-1 生長(zhǎng)的影響

在重金屬污染環(huán)境中，往往含有其他的重金屬離子，了解其他重金屬離子對(duì)菌株 4-1的影響，有助于掌握菌株的生物特性。從圖5可知，在培養(yǎng)液中加入100 mg/L Zn2+、Cu2+對(duì)菌株生長(zhǎng)沒有明顯影響，但加入100 mg/L Pb2+，菌液的吸光度明顯下降，說明Pb2+能抑制菌株的生長(zhǎng)。

3 結(jié)論與討論

本研究從重金屬污染環(huán)境中分離篩選到4株耐鎘微生物，鎘吸附試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株4-1對(duì)鎘吸附能力最強(qiáng)，吸附率達(dá)到90.0%。經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rDNA序列分析，將菌株4-1鑒定為金黃桿菌。微生物在生長(zhǎng)過程中受多種環(huán)境因素如溫度、pH值、溶氧量、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等的影響。本試驗(yàn)研究了通氣量及金屬離子對(duì)菌株4-1生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明菌株4-1的生長(zhǎng)受培養(yǎng)液中溶氧量的影響，且培養(yǎng)液中加入一定量的Pb2+后會(huì)明顯抑制菌株4-1的生長(zhǎng)。

4株耐鎘微生物的鎘吸附試驗(yàn)結(jié)果表明，耐鎘性較強(qiáng)的菌株2-1、2-2對(duì)鎘的吸附能力一般，而相對(duì)耐鎘能力弱的菌株4-1卻表現(xiàn)出較強(qiáng)的鎘吸附能力，造成這種現(xiàn)象可能與吸附試驗(yàn)中培養(yǎng)液的pH值[8，10]、有效鎘濃度[8]、溶質(zhì)類型[11]等因素有關(guān)。

利用吸附能力強(qiáng)的微生物修復(fù)重金屬污染的土壤，可以克服物理化學(xué)方法易造成二次污染的缺點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。但在實(shí)際應(yīng)用中，獲得的微生物要達(dá)到最大程度的生物修復(fù)作用，還必須考慮其他因素，如作物類型、土壤理化性質(zhì)（有機(jī)質(zhì)含量、堿解氮含量、速效氮含量、速效鉀含量、pH值）等。因此，菌株4-1對(duì)鎘的吸附機(jī)理及其影響因素等仍需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]洪克非. 湘江鎘污染事件內(nèi)幕追蹤[J]. 湖南安全與防災(zāi)，2006，9（2）：18-21.

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[5]蘇海佳，賀小進(jìn)，譚天偉.球形殼聚糖樹脂對(duì)含重金屬離子廢水的吸附性能研究[J]. 北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，30（2）：19-22.

[6]周志峰，張進(jìn)忠，魏世強(qiáng)，等. 1株芽孢桿菌吸附鎘和銅的研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，28（3）：396-401.

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[9]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001：25-105.

[10]López A，Lázaro N，Priego J M，et al. Effect of pH on the biosorption of nickel and other heavy metals by Pseudomonas fluorescens 4F39[J]. J Ind Microbiol and Biotechonl，2000，24（2）：146-151.

[11]El-Helow E R，Sabry S A，Amer R M. cadmium biosorption by a cadmium resistant strain of Bacillus thuringiensis：regulation and optimization of cell surface affinity for metal cations[J]. Biometals，2000，13（4）：273-280.endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鎘微生物的分離純化

在30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)2、7 d，在不含鎘的平板上共分離純化得到22株優(yōu)勢(shì)菌株，其中細(xì)菌菌株21株，霉菌菌株1株。在含鎘濃度為100 mg/L的平板上有14株菌株生長(zhǎng)較好；當(dāng)鎘濃度提高到800 mg/L時(shí)，仍有4株菌株可以生長(zhǎng)，結(jié)果如表1所示。

2.5 重金屬離子對(duì)菌株 4-1 生長(zhǎng)的影響

在重金屬污染環(huán)境中，往往含有其他的重金屬離子，了解其他重金屬離子對(duì)菌株 4-1的影響，有助于掌握菌株的生物特性。從圖5可知，在培養(yǎng)液中加入100 mg/L Zn2+、Cu2+對(duì)菌株生長(zhǎng)沒有明顯影響，但加入100 mg/L Pb2+，菌液的吸光度明顯下降，說明Pb2+能抑制菌株的生長(zhǎng)。

3 結(jié)論與討論

本研究從重金屬污染環(huán)境中分離篩選到4株耐鎘微生物，鎘吸附試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株4-1對(duì)鎘吸附能力最強(qiáng)，吸附率達(dá)到90.0%。經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rDNA序列分析，將菌株4-1鑒定為金黃桿菌。微生物在生長(zhǎng)過程中受多種環(huán)境因素如溫度、pH值、溶氧量、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等的影響。本試驗(yàn)研究了通氣量及金屬離子對(duì)菌株4-1生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明菌株4-1的生長(zhǎng)受培養(yǎng)液中溶氧量的影響，且培養(yǎng)液中加入一定量的Pb2+后會(huì)明顯抑制菌株4-1的生長(zhǎng)。

4株耐鎘微生物的鎘吸附試驗(yàn)結(jié)果表明，耐鎘性較強(qiáng)的菌株2-1、2-2對(duì)鎘的吸附能力一般，而相對(duì)耐鎘能力弱的菌株4-1卻表現(xiàn)出較強(qiáng)的鎘吸附能力，造成這種現(xiàn)象可能與吸附試驗(yàn)中培養(yǎng)液的pH值[8，10]、有效鎘濃度[8]、溶質(zhì)類型[11]等因素有關(guān)。

利用吸附能力強(qiáng)的微生物修復(fù)重金屬污染的土壤，可以克服物理化學(xué)方法易造成二次污染的缺點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。但在實(shí)際應(yīng)用中，獲得的微生物要達(dá)到最大程度的生物修復(fù)作用，還必須考慮其他因素，如作物類型、土壤理化性質(zhì)（有機(jī)質(zhì)含量、堿解氮含量、速效氮含量、速效鉀含量、pH值）等。因此，菌株4-1對(duì)鎘的吸附機(jī)理及其影響因素等仍需進(jìn)一步研究。

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2 結(jié)果與分析

2.1 耐鎘微生物的分離純化

在30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)2、7 d，在不含鎘的平板上共分離純化得到22株優(yōu)勢(shì)菌株，其中細(xì)菌菌株21株，霉菌菌株1株。在含鎘濃度為100 mg/L的平板上有14株菌株生長(zhǎng)較好；當(dāng)鎘濃度提高到800 mg/L時(shí)，仍有4株菌株可以生長(zhǎng)，結(jié)果如表1所示。

2.5 重金屬離子對(duì)菌株 4-1 生長(zhǎng)的影響

在重金屬污染環(huán)境中，往往含有其他的重金屬離子，了解其他重金屬離子對(duì)菌株 4-1的影響，有助于掌握菌株的生物特性。從圖5可知，在培養(yǎng)液中加入100 mg/L Zn2+、Cu2+對(duì)菌株生長(zhǎng)沒有明顯影響，但加入100 mg/L Pb2+，菌液的吸光度明顯下降，說明Pb2+能抑制菌株的生長(zhǎng)。

3 結(jié)論與討論

本研究從重金屬污染環(huán)境中分離篩選到4株耐鎘微生物，鎘吸附試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株4-1對(duì)鎘吸附能力最強(qiáng)，吸附率達(dá)到90.0%。經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rDNA序列分析，將菌株4-1鑒定為金黃桿菌。微生物在生長(zhǎng)過程中受多種環(huán)境因素如溫度、pH值、溶氧量、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等的影響。本試驗(yàn)研究了通氣量及金屬離子對(duì)菌株4-1生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明菌株4-1的生長(zhǎng)受培養(yǎng)液中溶氧量的影響，且培養(yǎng)液中加入一定量的Pb2+后會(huì)明顯抑制菌株4-1的生長(zhǎng)。

4株耐鎘微生物的鎘吸附試驗(yàn)結(jié)果表明，耐鎘性較強(qiáng)的菌株2-1、2-2對(duì)鎘的吸附能力一般，而相對(duì)耐鎘能力弱的菌株4-1卻表現(xiàn)出較強(qiáng)的鎘吸附能力，造成這種現(xiàn)象可能與吸附試驗(yàn)中培養(yǎng)液的pH值[8，10]、有效鎘濃度[8]、溶質(zhì)類型[11]等因素有關(guān)。

利用吸附能力強(qiáng)的微生物修復(fù)重金屬污染的土壤，可以克服物理化學(xué)方法易造成二次污染的缺點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。但在實(shí)際應(yīng)用中，獲得的微生物要達(dá)到最大程度的生物修復(fù)作用，還必須考慮其他因素，如作物類型、土壤理化性質(zhì)（有機(jī)質(zhì)含量、堿解氮含量、速效氮含量、速效鉀含量、pH值）等。因此，菌株4-1對(duì)鎘的吸附機(jī)理及其影響因素等仍需進(jìn)一步研究。

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