蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶發(fā)酵條件的初步優(yōu)化

何燦等

摘要：蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶在食品行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景，通過對蛋白質(zhì)的脫酰胺基作用，可以促進植物蛋白的溶解、乳化和起泡等。對產(chǎn)吲哚金黃桿菌產(chǎn)生蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的代謝曲線和發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行研究，結(jié)果表明，發(fā)酵液氨濃度和pH值隨發(fā)酵時間延長而升高，發(fā)酵12 h酶活最高，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為5.2時酶活最高；通過單因素試驗，確定乳糖和蔗糖為最適碳源，大豆蛋白胨和多聚蛋白胨為最適氮源；正交試驗結(jié)果表明，大豆蛋白胨、乳糖和Tween 80最適濃度分別為1.2%、0.7%和0.15%，培養(yǎng)基優(yōu)化后酶活最高為0.661 U/mL。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)吲哚金黃桿菌；蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶；培養(yǎng)基；優(yōu)化

中圖分類號： TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0218-03

植物蛋白（如大豆蛋白、小麥蛋白和玉米蛋白等）在食品工業(yè)中應(yīng)用非常廣泛，但由于在弱酸性環(huán)境中（大多數(shù)食品系統(tǒng)的pH值范圍）存在溶解性差、穩(wěn)定性低等問題，如在植物蛋白飲料產(chǎn)品中出現(xiàn)蛋白沉淀、脂肪上浮現(xiàn)象，使產(chǎn)品口感和外觀變差，產(chǎn)品保質(zhì)期縮短[1]，造成植物蛋白在生產(chǎn)應(yīng)用中受到限制。

植物蛋白含有大量的谷氨酰胺殘基，通過脫酰胺基作用可以改善植物蛋白的溶解性。Yong等通過酶法分別脫去部分玉米膠蛋白和小麥蛋白的氨基，使蛋白質(zhì)溶解性得到提高[2-3]。通過蛋白質(zhì)的脫氨基作用，不僅能夠提高蛋白質(zhì)在酸性條件下的溶解性，而且可以提高其乳化性、發(fā)泡性和凝膠性等多種功能特性，這些都是食品蛋白質(zhì)的必需性能。因此，催化蛋白質(zhì)脫酰胺基酶在工業(yè)應(yīng)用中具有很大潛力。目前，報道能催化蛋白質(zhì)脫酰胺基作用的酶有谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶、蛋白酶和肽谷氨酰胺酶[4-6]。蛋白酶和谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的主要酶促反應(yīng)不是蛋白質(zhì)殘基中谷氨酰胺的脫氨基作用，因此，用于植物蛋白脫氨時有副作用，會給食品帶來不利影響。肽谷氨酰胺酶雖然脫氨具有專一性，但是僅以多肽為底物進行反應(yīng)，對大分子蛋白質(zhì)沒有作用[6]。2000年，日本學(xué)者Yamaguchi等發(fā)現(xiàn)了1種由微生物產(chǎn)生的新的脫酰胺基酶——微生物蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶[7]，該酶是由從土壤中分離出的1株金黃桿菌（Chryseobacterium proteolyticum）產(chǎn)生，對酪氨酸和 Cbz-Gln-Gly（苯甲基氧化碳酰-L-谷氨酰胺甘氨酸）均有脫酰胺基活性，而沒有蛋白酶和谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性，這是首次報道的微生物產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶[3]。

筆者所在實驗室從土壤中篩選出了1株產(chǎn)吲哚金黃桿菌（Chryseobacterium indologenes），能夠產(chǎn)生微生物蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶。本研究對該產(chǎn)吲哚金黃桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行初步優(yōu)化，為其進一步工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 產(chǎn)吲哚金黃桿菌由華東師范大學(xué)微生物實驗室分離并保存。

1.1.2 試劑 Cbz-Gln-Gly，購自Sigma公司；大豆蛋白胨、多聚蛋白胨生化純，購自上海生工生物科技有限公司；酵母提取物，購自安琪酵母有限公司；苯酚、硝普鈉等常規(guī)試劑分析純，購自上海化學(xué)試劑公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（1 000 mL）：多聚蛋白胨10 g、酵母提取物2 g、MgSO4·7H2O 1 g，調(diào)節(jié)pH值至7.0；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（1 000 mL）：乳糖5 g、多聚蛋白胨10 g、NaH2PO4·H2O 1.7 g、 K2HPO4 0.25 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、FeSO4·7H2O 0.05 g，調(diào)節(jié)pH值至7.2。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng)：菌種活化后，以2%接種量接入種子培養(yǎng)基，200 r/min、25 ℃震蕩培養(yǎng)12 h。發(fā)酵培養(yǎng)：以1%接種量把種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，200 r/min、25 ℃震蕩培養(yǎng)。

1.2.2 酶活性測定方法[7] 100 μL含有10 mmol/L Cbz-Gln-Gly和175.6 mmol/L磷酸鈉緩沖液的底物溶液，與 10 μL 酶液混合均勻，37 ℃溫浴30 min，然后加入100 μL 12%三氯乙酸終止反應(yīng)；對照反應(yīng)是先加入三氯乙酸，后再加入酶液。18 000 r/min 離心5 min，上清液中釋放的氨用盧玉棋的方法[8]檢測。酶活性單位定義為：釋放氨1 μmol/min的酶量為1個酶活性單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)吲哚金黃桿菌代謝曲線

從圖1可以看出，產(chǎn)吲哚金黃桿菌延滯期較短，接種后 4 h 進入對數(shù)期，發(fā)酵12 h后逐漸進入穩(wěn)定期，最終發(fā)酵液D600 nm可達(dá)到1.187；發(fā)酵液pH值隨著發(fā)酵時間的延長不斷升高，當(dāng)進入穩(wěn)定期時pH值達(dá)到8.7，這一變化趨勢和發(fā)酵液中氨濃度趨勢一樣，這是因為發(fā)酵液中蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨，氨濃度不斷升高，導(dǎo)致pH值升高，與Yamaguchi等的研究結(jié)果[7]一致。蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的活性隨著發(fā)酵時間延長而增加，12 h達(dá)到最大，為0.37 U/mL，隨后又略有下降。

2.2 初始發(fā)酵pH值

發(fā)酵液初始pH值分別設(shè)為5.2、6.2、7.2、8.2、9.2，發(fā)酵12 h時測定酶活性。由圖2可見，pH值5.2時酶活性最高，為0.514 U/mL，這可能是因為發(fā)酵后期大量產(chǎn)氨，導(dǎo)致pH值升高（圖1），初始pH值低可以延緩pH值升高，而較低的pH值有利于增加酶活性。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基對蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的影響

2.3.1 碳源 試驗選擇速效碳源葡萄糖、蔗糖、乳糖和緩效碳源糊精、淀粉作為常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源，分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加5%濃度，發(fā)酵12 h后測定酶活性。由圖3可見，當(dāng)碳源為5%乳糖和5%蔗糖時酶活性較高，分別為 0.390 U/mL

和 0.412 U/mL，表明速效碳源有利于產(chǎn)酶。

2.3.2 氮源 試驗選取有機氮源植物水解蛋白、多聚蛋白胨、大豆蛋白胨和無機氮源硫酸銨、氯化銨作為氮源，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1%濃度，發(fā)酵12 h后測定酶活性。由圖4可以看出，以1%大豆蛋白胨和1%多聚蛋白胨為氮源時酶活性較高，分別為0.460 U/mL和0.480 U/mL，表明有機氮源適合產(chǎn)酶。

2.3.3 表面活性劑 不同表面活性劑對產(chǎn)酶有很大影響。由表1可見，0.15% Tween 80和0.15% Tween 40酶活性最高，均為0.530 U/mL，和對照相比，酶活性增加了26%；在試驗濃度范圍內(nèi)，Tween 20和曲拉通比對照酶活性低。3 小結(jié)與討論

脫氨基是提高植物蛋白食品功能最有價值的方法之一。蛋白質(zhì)谷氨酰胺殘基側(cè)鏈酰胺基中的氨基脫掉后生成羧基，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水合程度和負(fù)電荷增加，因此，蛋白質(zhì)的溶解性增加[9]。Matsudomi等研究表明，即使少量的脫氨也會大幅度提高蛋白質(zhì)的功能特性[10]。化學(xué)脫氨基法雖然可以提高植物蛋白（如小麥蛋白）的乳化性和起泡性，但是，該方法會引起蛋白質(zhì)肽鏈斷裂，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解而失去蛋白質(zhì)的功能。與化學(xué)脫氨法相比，酶法脫氨更為理想，底物專一，如蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶僅作用于蛋白質(zhì)中的谷氨酰胺，反應(yīng)條件溫和，而且安全性高。

對蛋白質(zhì)脫氨的酶目前報道比較多的主要有谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶、蛋白酶、肽谷氨酰胺酶和蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶。蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶已經(jīng)應(yīng)用于α-玉米蛋白、小麥蛋白和大豆蛋白[2-3，11]，還有乳清蛋白、脫脂牛奶[12-13]。微生物蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶由Yamaguchi等2000年首次從Chryseobacterium proteolyticum發(fā)酵產(chǎn)生，并對土壤中分離的菌種進行了鑒定，對其發(fā)酵進行了初步研究，其發(fā)酵上清液以Cbz-Gln-Gly為底物的谷氨酰胺酶活性最高，為0.258 U/mL，且最高酶活性在發(fā)酵24 h出現(xiàn)[7]。本試驗通過單因素試驗和正交試驗，得到最優(yōu)培養(yǎng)配方（1 000 mL）為大豆蛋白胨12 g、乳糖7 g、Tween 80 1.5 g、NaH2PO4·H2O 1.7 g、K2HPO4 0.25 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、FeSO4·7H2O 0.05 g，經(jīng)過該優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵，最高酶活性可達(dá)0.661 U/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Yamaguchi等的試驗結(jié)果，且最高酶活性在發(fā)酵12 h后即可出現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：

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[13]Miwa N，Yokoyama K，Wakabayashi H，et al. Effect of deamidation by protein-glutaminase on physicochemical and functional properties of skim milk[J]. International Dairy Journal，2010，20（6）：393-399.

和 0.412 U/mL，表明速效碳源有利于產(chǎn)酶。

2.3.2 氮源 試驗選取有機氮源植物水解蛋白、多聚蛋白胨、大豆蛋白胨和無機氮源硫酸銨、氯化銨作為氮源，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1%濃度，發(fā)酵12 h后測定酶活性。由圖4可以看出，以1%大豆蛋白胨和1%多聚蛋白胨為氮源時酶活性較高，分別為0.460 U/mL和0.480 U/mL，表明有機氮源適合產(chǎn)酶。

2.3.3 表面活性劑 不同表面活性劑對產(chǎn)酶有很大影響。由表1可見，0.15% Tween 80和0.15% Tween 40酶活性最高，均為0.530 U/mL，和對照相比，酶活性增加了26%；在試驗濃度范圍內(nèi)，Tween 20和曲拉通比對照酶活性低。3 小結(jié)與討論

脫氨基是提高植物蛋白食品功能最有價值的方法之一。蛋白質(zhì)谷氨酰胺殘基側(cè)鏈酰胺基中的氨基脫掉后生成羧基，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水合程度和負(fù)電荷增加，因此，蛋白質(zhì)的溶解性增加[9]。Matsudomi等研究表明，即使少量的脫氨也會大幅度提高蛋白質(zhì)的功能特性[10]。化學(xué)脫氨基法雖然可以提高植物蛋白（如小麥蛋白）的乳化性和起泡性，但是，該方法會引起蛋白質(zhì)肽鏈斷裂，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解而失去蛋白質(zhì)的功能。與化學(xué)脫氨法相比，酶法脫氨更為理想，底物專一，如蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶僅作用于蛋白質(zhì)中的谷氨酰胺，反應(yīng)條件溫和，而且安全性高。

對蛋白質(zhì)脫氨的酶目前報道比較多的主要有谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶、蛋白酶、肽谷氨酰胺酶和蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶。蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶已經(jīng)應(yīng)用于α-玉米蛋白、小麥蛋白和大豆蛋白[2-3，11]，還有乳清蛋白、脫脂牛奶[12-13]。微生物蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶由Yamaguchi等2000年首次從Chryseobacterium proteolyticum發(fā)酵產(chǎn)生，并對土壤中分離的菌種進行了鑒定，對其發(fā)酵進行了初步研究，其發(fā)酵上清液以Cbz-Gln-Gly為底物的谷氨酰胺酶活性最高，為0.258 U/mL，且最高酶活性在發(fā)酵24 h出現(xiàn)[7]。本試驗通過單因素試驗和正交試驗，得到最優(yōu)培養(yǎng)配方（1 000 mL）為大豆蛋白胨12 g、乳糖7 g、Tween 80 1.5 g、NaH2PO4·H2O 1.7 g、K2HPO4 0.25 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、FeSO4·7H2O 0.05 g，經(jīng)過該優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵，最高酶活性可達(dá)0.661 U/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Yamaguchi等的試驗結(jié)果，且最高酶活性在發(fā)酵12 h后即可出現(xiàn)。

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和 0.412 U/mL，表明速效碳源有利于產(chǎn)酶。

2.3.2 氮源 試驗選取有機氮源植物水解蛋白、多聚蛋白胨、大豆蛋白胨和無機氮源硫酸銨、氯化銨作為氮源，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1%濃度，發(fā)酵12 h后測定酶活性。由圖4可以看出，以1%大豆蛋白胨和1%多聚蛋白胨為氮源時酶活性較高，分別為0.460 U/mL和0.480 U/mL，表明有機氮源適合產(chǎn)酶。

2.3.3 表面活性劑 不同表面活性劑對產(chǎn)酶有很大影響。由表1可見，0.15% Tween 80和0.15% Tween 40酶活性最高，均為0.530 U/mL，和對照相比，酶活性增加了26%；在試驗濃度范圍內(nèi)，Tween 20和曲拉通比對照酶活性低。3 小結(jié)與討論

脫氨基是提高植物蛋白食品功能最有價值的方法之一。蛋白質(zhì)谷氨酰胺殘基側(cè)鏈酰胺基中的氨基脫掉后生成羧基，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水合程度和負(fù)電荷增加，因此，蛋白質(zhì)的溶解性增加[9]。Matsudomi等研究表明，即使少量的脫氨也會大幅度提高蛋白質(zhì)的功能特性[10]。化學(xué)脫氨基法雖然可以提高植物蛋白（如小麥蛋白）的乳化性和起泡性，但是，該方法會引起蛋白質(zhì)肽鏈斷裂，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解而失去蛋白質(zhì)的功能。與化學(xué)脫氨法相比，酶法脫氨更為理想，底物專一，如蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶僅作用于蛋白質(zhì)中的谷氨酰胺，反應(yīng)條件溫和，而且安全性高。

對蛋白質(zhì)脫氨的酶目前報道比較多的主要有谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶、蛋白酶、肽谷氨酰胺酶和蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶。蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶已經(jīng)應(yīng)用于α-玉米蛋白、小麥蛋白和大豆蛋白[2-3，11]，還有乳清蛋白、脫脂牛奶[12-13]。微生物蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶由Yamaguchi等2000年首次從Chryseobacterium proteolyticum發(fā)酵產(chǎn)生，并對土壤中分離的菌種進行了鑒定，對其發(fā)酵進行了初步研究，其發(fā)酵上清液以Cbz-Gln-Gly為底物的谷氨酰胺酶活性最高，為0.258 U/mL，且最高酶活性在發(fā)酵24 h出現(xiàn)[7]。本試驗通過單因素試驗和正交試驗，得到最優(yōu)培養(yǎng)配方（1 000 mL）為大豆蛋白胨12 g、乳糖7 g、Tween 80 1.5 g、NaH2PO4·H2O 1.7 g、K2HPO4 0.25 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、FeSO4·7H2O 0.05 g，經(jīng)過該優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵，最高酶活性可達(dá)0.661 U/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Yamaguchi等的試驗結(jié)果，且最高酶活性在發(fā)酵12 h后即可出現(xiàn)。

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