新城疫病毒LaSota株的毒株復壯鑒定試驗
2014-07-16 08:24:00戴建華馬晨輝王永娟
江蘇農業科學 2014年3期
戴建華+馬晨輝+王永娟
摘要：將凍存已久的新城疫病毒LaSota株在雞胚中連傳5代，獲得E1～E5代病毒，選取代表性的E1和E5病毒進行病毒生物學與免疫原性鑒定。通過透射電鏡法觀察病毒粒子形態，利用血凝試驗測定病毒的血凝價，借助1日齡雛雞腦內注射的致病指數、最小致死量病毒致死雞胚的平均時間、雞胚致病率、雞胚半數感染量等指標判定病毒的毒力或致病率，以雛雞免疫試驗確定病毒的安全性與免疫原性。結果表明，引入的LaSota株經過復壯，無論從形態還是從生化特性、免疫學特性方面，均符合低毒力活疫苗株的要求，可以用作單聯苗或多聯苗的制備。
關鍵詞：新城疫；LaSota株；復壯；鑒定
中圖分類號： S858.315.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0164-02
新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的禽類急性致死性傳染病，傳播速度快，長期以來對我國的養禽業構成了巨大威脅[1-5]。為了防治新城疫，除應用嚴格的生物安全措施、防止新城疫病毒強毒進入禽群外，疫苗免疫是必不可少的手段。在我國，使用低毒力活疫苗和油乳劑滅活苗已成為大多數禽場防制新城疫的常規手段[6]。新城疫病毒LaSota株是我國普遍使用的疫苗株，本試驗復壯的毒株是1986年從英國中央獸醫實驗室引進的由中國農業科學院上海獸醫研究所保存的凍干毒，作為疫苗毒種，筆者對其生物學和免疫學特性進行了系統鑒定，現將有關試驗結果報道如下。
1 材料與方法
1.1 材料
新城疫病毒LaSota株由中國農業科學院上海獸醫研究所提供；新城疫病毒標準株F48E8購自中國獸醫藥品監察所；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司；SPF雞購自山東省農業科學院SPF雞場。
1.2 LaSota毒株的復壯與傳代
對保存的凍干毒以生理鹽水稀釋100倍后，接種 0.1 mL 于10日齡SPF雞胚，收集24 h后死亡雞胚尿囊液為E0代毒，后將E0代毒按同樣方法在10日齡SPF雞胚中續傳5次得到E1至E5代病毒。
1.3 形態學觀察
收集E5代病毒尿囊液，15 000 r/min離心60 min，取沉淀懸液滴于有支持膜的銅網上，10 min后用干凈濾紙從網邊吸去液體，另滴加3%磷鎢酸（pH值6.0）染色2～3 min，之后吸去液體立即進行透射電鏡觀察。
1.4 病毒血凝試驗
參考文獻[7]的方法，用微量法在V型反應板上測定 E0至E5 代病毒的血凝價。
1.5 病毒毒力測定
參考文獻[8]的方法，測定新城疫病毒E1代和E5代病毒的1日齡雛雞腦內注射的致病指數（ICPI）與最小致死量病毒致死雞胚的平均時間（MDT）。雞或雞胚的樣本數均為10。
1.6 病毒EID50測定
參考文獻[9]的方法，對E1代和E5代病毒用滅菌生理鹽水作10倍梯度稀釋，各取0.1 mL 10-7、10-8、10-9 3個稀釋度病毒液尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚5個，棄去48 h前死亡的雞胚，隨時取出48～120 h死亡的雞胚，2～8 ℃冷卻后收獲尿囊液，同一稀釋度的尿囊液等量混合，分別測定紅細胞凝集價，至120 h取出所有活胚，逐個收獲尿囊液，分別測定紅細胞凝集價，紅細胞凝集價≥1 ∶ 128者判為感染，計算雞胚半數感染量（EID50）。
1.7 雞胚致病率測定
取E1代和E5代病毒，用滅菌生理鹽水稀釋100倍，按照每胚0.1 mL劑量尿囊腔接種10日齡SPF雞胚10個，置 37 ℃ 繼續孵育，記錄24～120 h內死亡雞胚數和胎兒病變。
1.8 安全性測定
將20羽5日齡SPF雛雞隨機分為2組，每組10羽。其中一組用滴鼻法[8]接種0.05 mL 5倍濃縮的含毒尿囊液，另一組作空白對照。相同條件下隔離飼養10 d，每天記錄雞群情況。
1.9 免疫原性測定
取病毒含量不同的E1代和E5代病毒，經0.1%甲醛滅活，按LaSota滅活苗質量起草說明書方法制備成單苗，按 10 000 EID50、5 000 EID50、1 000 EID50、500 EID50的劑量免疫7日齡SPF雛雞，每個劑量10羽。28日齡時用100 000 EID50的F48E8強毒株攻擊，120 h內記錄死亡率和疫苗的保護率。
2 結果與分析
2.1 形態學檢測結果
通過透射電鏡觀察復壯后的新城疫病毒粒子，結果顯示新城疫病毒粒子呈圓形或橢圓形，直徑100～500 nm，外周有囊膜，囊膜上有長約10 nm的纖突（圖1）。
3 結論與討論
透射電鏡觀察結果顯示，病毒粒子具有明顯的新城疫病毒特征，說明病毒存在，并初步認為毒株正確。引進的LaSota株經復壯后能在雞胚良好繁殖，在雞胚中連傳5代，雞胚尿囊液中血凝滴度均達29以上，說明毒株是穩定的。從對該毒株系統鑒定的結果看，其紅細胞凝集價、1日齡雛雞腦內注射的致病指數（ICPI）、最小致死量病毒致死雞胚的平均時間（MDT）、對雞胚毒力、安全性、免疫原性等都符合新城疫低毒力活疫苗株的要求。
上述系統的鑒定試驗證明，引入的LaSota株經過復壯，無論從形態還是從生化特性、免疫學特性方面均符合低毒力活疫苗株的要求，可以用作單聯苗或多聯苗的制備。
參考文獻：
[1]童光志. 動物傳染病學[M]. 北京：中國農業出版社，2005.
[2]梁淑珍，郭 兵，王海風. 中藥復方對雞新城疫疫苗免疫效果的影響[J]. 江蘇農業科學，2012，40（2）：176-178.
[3]段志強，胡 嬌，胡增壘，等. 鵝源新城疫病毒M基因的原核表達及其多克隆抗體制備[J]. 江蘇農業學報，2012，28（1）：125-130.
[4]魏 寧，桂文龍，李巨銀，等. 新城疫疫苗及免疫程序對蛋雞免疫效果的研究[J]. 江蘇農業科學，2012，40（11）：232-234.
[5]于 洋，封 振，何孔旺，等. 新城疫病毒毒力分子機制研究進展[J]. 江蘇農業學報，2013，29（2）：435-439.
[6]楊 煦，劉玉芬，劉懷然. 新城疫疫苗的研究進展[J]. 現代農業科技，2012，2（2）：325-327.
[7]Saif Y M. 禽病學[M]. 蘇敬良，高福，索勛主，譯. 11版. 北京：中國農業出版社，2005：711-733.
摘要：將凍存已久的新城疫病毒LaSota株在雞胚中連傳5代，獲得E1～E5代病毒，選取代表性的E1和E5病毒進行病毒生物學與免疫原性鑒定。通過透射電鏡法觀察病毒粒子形態，利用血凝試驗測定病毒的血凝價，借助1日齡雛雞腦內注射的致病指數、最小致死量病毒致死雞胚的平均時間、雞胚致病率、雞胚半數感染量等指標判定病毒的毒力或致病率，以雛雞免疫試驗確定病毒的安全性與免疫原性。結果表明，引入的LaSota株經過復壯，無論從形態還是從生化特性、免疫學特性方面，均符合低毒力活疫苗株的要求，可以用作單聯苗或多聯苗的制備。
關鍵詞：新城疫；LaSota株；復壯；鑒定
中圖分類號： S858.315.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0164-02
新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的禽類急性致死性傳染病，傳播速度快，長期以來對我國的養禽業構成了巨大威脅[1-5]。為了防治新城疫，除應用嚴格的生物安全措施、防止新城疫病毒強毒進入禽群外，疫苗免疫是必不可少的手段。在我國，使用低毒力活疫苗和油乳劑滅活苗已成為大多數禽場防制新城疫的常規手段[6]。新城疫病毒LaSota株是我國普遍使用的疫苗株，本試驗復壯的毒株是1986年從英國中央獸醫實驗室引進的由中國農業科學院上海獸醫研究所保存的凍干毒，作為疫苗毒種，筆者對其生物學和免疫學特性進行了系統鑒定，現將有關試驗結果報道如下。
1 材料與方法
1.1 材料
新城疫病毒LaSota株由中國農業科學院上海獸醫研究所提供；新城疫病毒標準株F48E8購自中國獸醫藥品監察所；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司；SPF雞購自山東省農業科學院SPF雞場。
1.2 LaSota毒株的復壯與傳代
對保存的凍干毒以生理鹽水稀釋100倍后，接種 0.1 mL 于10日齡SPF雞胚，收集24 h后死亡雞胚尿囊液為E0代毒，后將E0代毒按同樣方法在10日齡SPF雞胚中續傳5次得到E1至E5代病毒。
1.3 形態學觀察
收集E5代病毒尿囊液，15 000 r/min離心60 min，取沉淀懸液滴于有支持膜的銅網上，10 min后用干凈濾紙從網邊吸去液體，另滴加3%磷鎢酸（pH值6.0）染色2～3 min，之后吸去液體立即進行透射電鏡觀察。
1.4 病毒血凝試驗
參考文獻[7]的方法，用微量法在V型反應板上測定 E0至E5 代病毒的血凝價。
1.5 病毒毒力測定
參考文獻[8]的方法，測定新城疫病毒E1代和E5代病毒的1日齡雛雞腦內注射的致病指數（ICPI）與最小致死量病毒致死雞胚的平均時間（MDT）。雞或雞胚的樣本數均為10。
1.6 病毒EID50測定
參考文獻[9]的方法，對E1代和E5代病毒用滅菌生理鹽水作10倍梯度稀釋，各取0.1 mL 10-7、10-8、10-9 3個稀釋度病毒液尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚5個，棄去48 h前死亡的雞胚，隨時取出48～120 h死亡的雞胚，2～8 ℃冷卻后收獲尿囊液，同一稀釋度的尿囊液等量混合，分別測定紅細胞凝集價，至120 h取出所有活胚，逐個收獲尿囊液，分別測定紅細胞凝集價，紅細胞凝集價≥1 ∶ 128者判為感染，計算雞胚半數感染量（EID50）。
1.7 雞胚致病率測定
取E1代和E5代病毒，用滅菌生理鹽水稀釋100倍，按照每胚0.1 mL劑量尿囊腔接種10日齡SPF雞胚10個，置 37 ℃ 繼續孵育，記錄24～120 h內死亡雞胚數和胎兒病變。
1.8 安全性測定
將20羽5日齡SPF雛雞隨機分為2組，每組10羽。其中一組用滴鼻法[8]接種0.05 mL 5倍濃縮的含毒尿囊液，另一組作空白對照。相同條件下隔離飼養10 d，每天記錄雞群情況。
1.9 免疫原性測定
取病毒含量不同的E1代和E5代病毒，經0.1%甲醛滅活，按LaSota滅活苗質量起草說明書方法制備成單苗，按 10 000 EID50、5 000 EID50、1 000 EID50、500 EID50的劑量免疫7日齡SPF雛雞，每個劑量10羽。28日齡時用100 000 EID50的F48E8強毒株攻擊，120 h內記錄死亡率和疫苗的保護率。
2 結果與分析
2.1 形態學檢測結果
通過透射電鏡觀察復壯后的新城疫病毒粒子，結果顯示新城疫病毒粒子呈圓形或橢圓形，直徑100～500 nm，外周有囊膜，囊膜上有長約10 nm的纖突（圖1）。
3 結論與討論
透射電鏡觀察結果顯示，病毒粒子具有明顯的新城疫病毒特征，說明病毒存在，并初步認為毒株正確。引進的LaSota株經復壯后能在雞胚良好繁殖，在雞胚中連傳5代，雞胚尿囊液中血凝滴度均達29以上，說明毒株是穩定的。從對該毒株系統鑒定的結果看，其紅細胞凝集價、1日齡雛雞腦內注射的致病指數（ICPI）、最小致死量病毒致死雞胚的平均時間（MDT）、對雞胚毒力、安全性、免疫原性等都符合新城疫低毒力活疫苗株的要求。
上述系統的鑒定試驗證明，引入的LaSota株經過復壯，無論從形態還是從生化特性、免疫學特性方面均符合低毒力活疫苗株的要求，可以用作單聯苗或多聯苗的制備。
參考文獻：
[1]童光志. 動物傳染病學[M]. 北京：中國農業出版社，2005.
[2]梁淑珍，郭 兵，王海風. 中藥復方對雞新城疫疫苗免疫效果的影響[J]. 江蘇農業科學，2012，40（2）：176-178.
[3]段志強，胡 嬌，胡增壘，等. 鵝源新城疫病毒M基因的原核表達及其多克隆抗體制備[J]. 江蘇農業學報，2012，28（1）：125-130.
[4]魏 寧，桂文龍，李巨銀，等. 新城疫疫苗及免疫程序對蛋雞免疫效果的研究[J]. 江蘇農業科學，2012，40（11）：232-234.
[5]于 洋，封 振，何孔旺，等. 新城疫病毒毒力分子機制研究進展[J]. 江蘇農業學報，2013，29（2）：435-439.
[6]楊 煦，劉玉芬，劉懷然. 新城疫疫苗的研究進展[J]. 現代農業科技，2012，2（2）：325-327.
[7]Saif Y M. 禽病學[M]. 蘇敬良，高福，索勛主，譯. 11版. 北京：中國農業出版社，2005：711-733.
摘要：將凍存已久的新城疫病毒LaSota株在雞胚中連傳5代，獲得E1～E5代病毒，選取代表性的E1和E5病毒進行病毒生物學與免疫原性鑒定。通過透射電鏡法觀察病毒粒子形態，利用血凝試驗測定病毒的血凝價，借助1日齡雛雞腦內注射的致病指數、最小致死量病毒致死雞胚的平均時間、雞胚致病率、雞胚半數感染量等指標判定病毒的毒力或致病率，以雛雞免疫試驗確定病毒的安全性與免疫原性。結果表明，引入的LaSota株經過復壯，無論從形態還是從生化特性、免疫學特性方面，均符合低毒力活疫苗株的要求，可以用作單聯苗或多聯苗的制備。
關鍵詞：新城疫；LaSota株；復壯；鑒定
中圖分類號： S858.315.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0164-02
新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的禽類急性致死性傳染病，傳播速度快，長期以來對我國的養禽業構成了巨大威脅[1-5]。為了防治新城疫，除應用嚴格的生物安全措施、防止新城疫病毒強毒進入禽群外，疫苗免疫是必不可少的手段。在我國，使用低毒力活疫苗和油乳劑滅活苗已成為大多數禽場防制新城疫的常規手段[6]。新城疫病毒LaSota株是我國普遍使用的疫苗株，本試驗復壯的毒株是1986年從英國中央獸醫實驗室引進的由中國農業科學院上海獸醫研究所保存的凍干毒，作為疫苗毒種，筆者對其生物學和免疫學特性進行了系統鑒定，現將有關試驗結果報道如下。
1 材料與方法
1.1 材料
新城疫病毒LaSota株由中國農業科學院上海獸醫研究所提供；新城疫病毒標準株F48E8購自中國獸醫藥品監察所；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司；SPF雞購自山東省農業科學院SPF雞場。
1.2 LaSota毒株的復壯與傳代
對保存的凍干毒以生理鹽水稀釋100倍后，接種 0.1 mL 于10日齡SPF雞胚，收集24 h后死亡雞胚尿囊液為E0代毒，后將E0代毒按同樣方法在10日齡SPF雞胚中續傳5次得到E1至E5代病毒。
1.3 形態學觀察
收集E5代病毒尿囊液，15 000 r/min離心60 min，取沉淀懸液滴于有支持膜的銅網上，10 min后用干凈濾紙從網邊吸去液體，另滴加3%磷鎢酸（pH值6.0）染色2～3 min，之后吸去液體立即進行透射電鏡觀察。
1.4 病毒血凝試驗
參考文獻[7]的方法，用微量法在V型反應板上測定 E0至E5 代病毒的血凝價。
1.5 病毒毒力測定
參考文獻[8]的方法，測定新城疫病毒E1代和E5代病毒的1日齡雛雞腦內注射的致病指數（ICPI）與最小致死量病毒致死雞胚的平均時間（MDT）。雞或雞胚的樣本數均為10。
1.6 病毒EID50測定
參考文獻[9]的方法，對E1代和E5代病毒用滅菌生理鹽水作10倍梯度稀釋，各取0.1 mL 10-7、10-8、10-9 3個稀釋度病毒液尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚5個，棄去48 h前死亡的雞胚，隨時取出48～120 h死亡的雞胚，2～8 ℃冷卻后收獲尿囊液，同一稀釋度的尿囊液等量混合，分別測定紅細胞凝集價，至120 h取出所有活胚，逐個收獲尿囊液，分別測定紅細胞凝集價，紅細胞凝集價≥1 ∶ 128者判為感染，計算雞胚半數感染量（EID50）。
1.7 雞胚致病率測定
取E1代和E5代病毒，用滅菌生理鹽水稀釋100倍，按照每胚0.1 mL劑量尿囊腔接種10日齡SPF雞胚10個，置 37 ℃ 繼續孵育，記錄24～120 h內死亡雞胚數和胎兒病變。
1.8 安全性測定
將20羽5日齡SPF雛雞隨機分為2組，每組10羽。其中一組用滴鼻法[8]接種0.05 mL 5倍濃縮的含毒尿囊液，另一組作空白對照。相同條件下隔離飼養10 d，每天記錄雞群情況。
1.9 免疫原性測定
取病毒含量不同的E1代和E5代病毒，經0.1%甲醛滅活，按LaSota滅活苗質量起草說明書方法制備成單苗，按 10 000 EID50、5 000 EID50、1 000 EID50、500 EID50的劑量免疫7日齡SPF雛雞，每個劑量10羽。28日齡時用100 000 EID50的F48E8強毒株攻擊，120 h內記錄死亡率和疫苗的保護率。
2 結果與分析
2.1 形態學檢測結果
通過透射電鏡觀察復壯后的新城疫病毒粒子，結果顯示新城疫病毒粒子呈圓形或橢圓形，直徑100～500 nm，外周有囊膜，囊膜上有長約10 nm的纖突（圖1）。
3 結論與討論
透射電鏡觀察結果顯示，病毒粒子具有明顯的新城疫病毒特征，說明病毒存在，并初步認為毒株正確。引進的LaSota株經復壯后能在雞胚良好繁殖，在雞胚中連傳5代，雞胚尿囊液中血凝滴度均達29以上，說明毒株是穩定的。從對該毒株系統鑒定的結果看，其紅細胞凝集價、1日齡雛雞腦內注射的致病指數（ICPI）、最小致死量病毒致死雞胚的平均時間（MDT）、對雞胚毒力、安全性、免疫原性等都符合新城疫低毒力活疫苗株的要求。
上述系統的鑒定試驗證明，引入的LaSota株經過復壯，無論從形態還是從生化特性、免疫學特性方面均符合低毒力活疫苗株的要求，可以用作單聯苗或多聯苗的制備。
參考文獻：
[1]童光志. 動物傳染病學[M]. 北京：中國農業出版社，2005.
[2]梁淑珍，郭 兵，王海風. 中藥復方對雞新城疫疫苗免疫效果的影響[J]. 江蘇農業科學，2012，40（2）：176-178.
[3]段志強，胡 嬌，胡增壘，等. 鵝源新城疫病毒M基因的原核表達及其多克隆抗體制備[J]. 江蘇農業學報，2012，28（1）：125-130.
[4]魏 寧，桂文龍，李巨銀，等. 新城疫疫苗及免疫程序對蛋雞免疫效果的研究[J]. 江蘇農業科學，2012，40（11）：232-234.
[5]于 洋，封 振，何孔旺，等. 新城疫病毒毒力分子機制研究進展[J]. 江蘇農業學報，2013，29（2）：435-439.
[6]楊 煦，劉玉芬，劉懷然. 新城疫疫苗的研究進展[J]. 現代農業科技，2012，2（2）：325-327.
[7]Saif Y M. 禽病學[M]. 蘇敬良，高福，索勛主，譯. 11版. 北京：中國農業出版社，2005：711-733.
