3種抗凋亡試劑在豬精液常溫保存中的應用效果

胡傳水等

摘要：將抗凋亡試劑葛根素（0、0.02、0.10、0.50、2.50 mmol/L）、酒石酸美托洛爾（0、0.02、0.10、0.50、2.50 mmol/L）、二氯乙酸鈉（0、0.04、0.20、1.00、5.00 mmol/L）加入稀釋液中，探討它們在豬精液常溫保存中的效果。結果表明：0.50 mmol/L 葛根素可以延長精子保存時間及存活指數（P<0.05）；0.50 mmol/L 酒石酸美托洛爾能降低精子畸形率（P<0.05）；5.00 mmol/L二氯乙酸鈉可以縮短精子存活時間和存活指數（P<0.05）。總之，合適濃度的葛根素或酒石酸美托洛爾可以顯著提高豬精液常溫保存后的品質，而二氯乙酸鈉對豬精液常溫保存效果沒有明顯的改善作用。

關鍵詞：豬；精液；常溫保存；抗凋亡試劑

中圖分類號： S828.3+4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0138-03

隨著人工授精（AI）技術在現代養豬業中發揮出更加巨大的作用，精液保存技術顯得日益重要，并愈加顯示出其在降低公豬飼養成本、提高經濟效益、加快育種速度、防止疾病傳播等方面的優勢[1]。與冷凍精液相比，常規液態保存精液具有設備要求低、操作過程簡單、所需費用低、繁殖成績好（受胎率、分娩率和窩產仔數較高）等優點[2]，所以，在豬人工授精技術中以使用常溫精液為主，占到使用精液總量的99%[3]。因此，豬精液常溫液態保存的研究對豬人工授精技術的發展乃至養豬生產具有很高的實用價值。相關的文獻[4-10]認為，人和動物精液射出體外之后，各種理化條件均會促進精子發生凋亡，而葛根素（Pur）、酒石酸美托洛爾（MTA）及二氯乙酸鈉（DCA）3種試劑可以抑制胞漿內游離Ca2+濃度的持續性升高，從而阻止細胞凋亡的發生[11-14]；但是，迄今為止未見這3種試劑在豬精液保存方面的應用報道。因此，本試驗探討Pur、MTA及DCA在豬精液常溫保存中的效果，為豬精液常溫保存稀釋液配方的改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備及試劑

Haier藥品保存箱（深圳市凱銘杰儀器設備有限公司），電子恒溫水浴鍋（廣州市富家電器廠），相差顯微鏡（OLYMPUS CH3_DO 6M01434），電子冷暖箱（北京福意聯電器有限公司），DJ-200電子天平（北京宏宇振興科貿有限公司）。乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）（國藥集團化學試劑有限公司），N-乙酰半胱氨酸（NAC）、Pur、MTA（阿拉丁試劑上海公司），DCA（西格瑪奧德里奇上海貿易有限公司），苯胺藍（天津市科密歐化學試劑開發中心），龍膽紫（天機博迪化工公司）。

1.2 精液的采集與處理

采用手握法采集健康、正常采精的長白、約克和杜洛克種公豬（飼養于廣西科達畜禽改良有限責任公司）中段精子濃密精液，用4層脫脂紗布過濾去除膠狀物，原精精子活力0.7以上，氣味、色澤正常者供稀釋保存用。

1.3 精液的稀釋與保存

按配方準確配制稀釋液，37 ℃等溫條件下按1 ∶ 2的比例稀釋，用紗布包裹后保存在16～18 ℃的常溫環境中。

1.4 精液品質檢查

1.4.1 精子存活時間 每隔一定時間檢查活力，直到精子全部死亡為止。記錄精子有效存活時間（精子活力為0.4的保存時間）、總存活時間（精子全部死亡的保存時間），并計算精子存活指數{∑[（上次活力+下次活力）/2×時間間隔]}。

1.4.2 精子的畸形率、頂體完整率 于保存72 h時進行檢查，具體步驟為：精液涂片→干燥→10%福爾馬林生理鹽水固定15 s→水洗→5%苯胺藍溶液染色15～20 s→水洗→0.5%龍膽紫水溶液染色4～6 s→水洗→干燥→鏡檢。

1.5 試驗設計

添加3種試劑的試驗均分為5個組，對照組的稀釋液為常用的葡萄糖-檸檬酸鈉-EDTA液（葡萄糖3.71%，檸檬酸鈉0.53%，碳酸氫鈉0.13%，NAC 0.02%，EDTA 0.13%，KCl 0.08%，青霉素0.06%，鏈霉素0.10%）[15]，試驗組1～4的稀釋液在對照組的基礎上分別添加0.02、0.10、0.50、2.50 mmol/L 的Pur或MTA，或0.04、0.20、1.00、5.00 mmol/L的DCA。所有試驗均重復6次。

1.6 數據處理

試驗所得的各組數據均以“x±s”表示，采用SPSS 13.0軟件進行方差分析，檢驗各組之間差異的顯著性。

2 結果與分析

2.1 Pur在豬精液常溫保存中的應用效果

如表1所示，從稀釋后活力、頂體完整率及畸形率來看，添加Pur的各個試驗組與對照組相比，差異不顯著（P>0.05）。在有效存活時間、總存活時間及存活指數方面，添加0.50 mmol/L Pur的試驗組顯著高于其他各組（P<005）。結果表明，在本試驗條件下，0.50 mmol/L 是Pur在豬精液常溫保存稀釋液中的最佳添加濃度。

3 討論

3.1 Pur對豬精液常溫保存效果的影響

Pur為豆科葛屬植物野葛及甘葛藤根異黃酮中的主要有效成分[16]，由于具有鈣離子拮抗和抗凋亡等多種藥理作用[11-12]而得到廣泛的臨床應用，特別是在心腦血管等疾病的治療[17]方面，近年來深受學者們的關注和重視，進行了大量的研究工作，取得了許多重要的研究進展。大量研究表明，在被各種因素誘導細胞凋亡出現之前，胞漿內游離Ca2+的濃度均持續性升高，抑制其升高則可阻止誘導的細胞發生凋亡。中山大學眼科中心發現Pur藥物治療可延緩視網膜脫離rd小鼠視網膜光感受器細胞層數或密度的減少，延緩外段盤膜部位的線粒體、盤膜以及外界膜的破壞，明顯降低7、14、21、28和35 d時rd小鼠視網膜光感受器細胞的凋亡率，同時增強rd小鼠視網膜外核層間質及其光感受器細胞外段Bcl-2的表達[18]。Pur不僅具有擴張冠狀動脈血管，抑制血小板聚集，提高心肌細胞耐缺血、缺氧的能力[19]，而且能抑制茶酚胺誘導的心肌損傷過程中FSA蛋白的表達，影響心肌細胞的凋亡，產生對心肌損傷的保護作用[20]。研究還發現，Pur可保護由于高壓引起的血管內皮細胞損傷，其主要原因可能與Pur的抗氧化、鈣離子拮抗和β受體阻滯等作用有關[21-22]。Pur對缺血再灌注損傷導致的心肌細胞凋亡具有抑制作用，多數學者認為其機理主要是由于灌注后胞內鈣離子、氧自由基增多導致細胞凋亡。在缺血再灌注前后，Bcl-2蛋白表達量發生改變，這是機體對抗凋亡的一種反應。Pur對氧自由基有清除作用，并能預防對抗各種氧化劑誘導引起的氧化性損傷[23]。通過試驗可見，在常溫稀釋液中添加 0.5 mmol/L 的Pur對改善豬精子的有效存活時間、總存活時間及存活指數均有良好效果，這可能與Pur增強了長壽基因即Bcl-2的表達、鈣離子拮抗、β受體阻滯并發揮了抗氧化作用有關，而 2.5 mmol/L Pur會顯著縮短豬精子存活時間，這說明Pur需要在一定濃度范圍內才能發揮對精子的保護作用。endprint

3.2 MTA對豬精液常溫保存效果的影響

MTA屬抗心律失常/抗高血壓類藥，為2A類即無部分激動活性的β1-受體阻斷藥（心臟選擇性β-受體阻斷藥），除了藥效學上具有β-受體阻滯劑的優點外，還可抑制中性粒細胞浸潤、減輕鈣負荷及清除氧自由基[13，24]。該藥品臨床應用多年，能有效治療高血壓、心絞痛、心肌梗塞、心律失常和慢性心力衰竭等心血管方面的疾病[25-27]。陳躍峰等的研究表明，MTA能減少急性心肌梗死、邊緣區和非梗死區的心肌細胞凋亡，它主要是通過增加Bcl-2的表達和抑制促細胞凋亡蛋白合成來實現這一功能[28]。趙梅等的研究結果表明，MTA能減少Fas和NF-KB蛋白的表達，而且大劑量的MTA干預對Fas和NF-KB的影響效果大于小劑量MTA，提示MTA的抗心肌細胞凋亡率取決于它對凋亡相關基因表達影響程度的差異和β-受體的阻斷作用[29]。本試驗在豬精液常溫稀釋液中添加不同濃度的MTA，結果顯示0.02、2.50 mmol/L MTA能夠提高精子稀釋后活力，0.50 mmol/L MTA能降低精子畸形率，這可能是MTA減輕鈣負荷、清除氧自由基、增加Bcl-2的表達和抑制促細胞凋亡蛋白合成，從而阻斷了細胞凋亡的緣故。

3.3 DCA對豬精液常溫保存效果的影響

DCA是一種多用于治療乳酸酸中毒的小分子藥物，近來的研究發現，它可以通過促進乳酸氧化、降低血液乳酸水平、改善機體的代謝平衡來治療一些代謝性疾病，如先天性或代償性乳酸酸中毒。在組織缺氧情況下，激烈運動會造成組織缺氧及高乳酸水平，DCA可通過增加氧攝取、激活丙酮酸脫氫酶復合物、促進乳酸氧化來補充能量供應，從而改善缺氧組織的能量代謝狀況[30]。何作云等的研究顯示，01、1、10 mmol/L DCA均能顯著降低缺氧后復氧的心肌細胞的凋亡率[14]。鑒于上述試驗基礎，本試驗把DCA添加到常溫稀釋液中看是否對豬精子同樣具有抗凋亡作用，結果表明，添加 5.00 mmol/L DCA降低了精子的存活時間和存活指數，而其他劑量DCA效果不顯著；0.04、0.20、1.00 mmol/L DCA 對豬精液常溫保存無顯著影響，其機制可能是與這些濃度下DCA不能有效改善精子的能量代謝狀況或降低精子的凋亡率有關；5.00 mmol/L DCA可以顯著降低精子的存活時間和存活指數。與學者們針對乳腺癌[31]、子宮內膜癌[32]、前列腺癌細胞[33]的研究結果類似，他們在DCA濃度為5 mmol/L 左右時即檢測到了對細胞明顯的增殖抑制及凋亡誘導作用。因此，DCA在較低濃度時對精子可能有改善能量代謝狀況及降低凋亡率的作用，而在較高濃度時反而會有誘導凋亡的作用，其在豬精液常溫保存的適宜濃度有待進一步研究。

4 結論

在本試驗條件下，合適濃度的Pur或MTA可以顯著提高豬精液常溫保存后的品質，而DCA對豬精液常溫保存效果沒有明顯的改善作用。

致謝：廣西畜禽品種改良站吳柱月研究員，韋干顯獸醫師，劉德玉、李芳芳、王英群、鄧祝新畜牧師；廣西科達畜禽改良有限責任公司彭夏云、韋永強、韋詩祥技術員；廣西大學動物科學專業2009級周文婷同學，在試驗中給予幫助，特致謝忱。

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