波爾山羊MC4R胞內3環基因片段單核苷酸多態性對體重的影響

張俊等

摘要：為探討黑素皮質素受體4（melanocortin receptor-4，MC4R）基因多態性對波爾山羊生長性狀的影響，對波爾山羊MC4R基因進行了克隆測序，篩選多態性位點。結果表明：MC4R胞內3環基因片段存在2個堿基顛換，分別是編碼區663 bp處C/A顛換、693 bp處C/T顛換；其中693 bp處C/T存在于Csp6Ⅰ酶切位點內，以此建立了基于 Csp6Ⅰ 酶切的PCR-RFLP檢測方法，并對163只波爾山羊進行檢測分析；在受檢波爾山羊中檢測到CC、CT 2種基因型，2種基因型在波爾山羊各月齡體重方面差異均不顯著，且在群體中表現為低度多態，群體遺傳雜合度較低，表明C693T位點在波爾山羊群體中的遺傳一致性較高。

關鍵詞：黑素皮質素受體4；克隆；PCR-RFLP；波爾山羊；生長

中圖分類號： Q343.1+5 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0013-03

黑素皮質素受體-4（melanocortin receptor-4，MC4R）分布于動物腦組織和腎上腺髓質，是從動物下丘腦腹內側核分泌的一種肽類物質[1]，其主要作用是通過與腦部分泌的天然內源配體α-促黑激素（α-Melanocyte stimulating hormone，α-MSH）結合，從而抑制體重增加[2]。1993年Gantz等最先克隆出人的MC4R基因，并將其定位于人染色體18q21.3[3]。1997年Huszar等首次證明了MC4R在能量平衡中的關鍵作用，即遺傳敲除MC4R基因的小鼠出現遺傳性肥胖，表現多食、肥胖、胰島素分泌過多等癥狀[4-5]。此后又有大量研究發現，MC4R在家畜的背膘厚、日增重、采食量等生長性狀中具有重要生物學活性，可作為選擇動物生長性狀的遺傳標記。本研究對波爾山羊MC4R基因進行了克隆和測序，尋找波爾山羊MC4R基因的多態性位點，分析其多態性與波爾山羊體重的關聯，以期為山羊分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

163只波爾山羊樣本由江蘇省農業科學院六合動物實驗基地統一飼養管理，營養水平以及管理水平保持一致。各月齡波爾山羊體重資料均由該基地提供。對各個體采集耳組織樣，置冰桶中帶回實驗室，-20 ℃保存。

1.2 組織DNA提取

組織樣DNA的提取采用酚/仿抽提法，TE Buffer 溶解后-20 ℃保存。

1.3 MC4R基因擴增

根據GenBank：EU622853.2設計引物。上游引物序列：TCCAAGTGATGCCGACCAG，下游引物序列：CTGGGCACTGCTTCACATC。PCR反應總體系20 μL，含模板DNA 60 ng，5 U/L Taq聚合酶0.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，10 μmol/L引物各0.6 μL，25 mmol/L MgCl2 1.2 μL，10×緩沖液2 μL，添加滅菌雙蒸水至20 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。

1.4 克隆與測序

PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨機選取10只波爾山羊的PCR產物用TaKaRa膠回收試劑盒回收后與 PMD-19T 載體連接，16 ℃培養過夜，轉化到大腸桿菌感受態細胞中，37 ℃培養16 h，挑陽性克隆送上海英駿公司測序。

1.5 突變位點篩選

將11個陽性克隆的測序結果與GenBank序列對比，確定突變位點。

1.6 PCR-RFLP分析

1.6.1 目的基因擴增 根據測序結果選擇其中一個突變位點（位于Csp6Ⅰ識別序列內），設計1對引物擴增MC4R基因Csp6Ⅰ位點上游158 bp，下游80 bp，共238 bp序列，上游引物序列為GTGTCGGGCGTCTTGTTC，下游引物序列為AGCAGACGACGAAGACCC。PCR反應總體系為20 μL，含模板DNA 60 ng，5 U/L Taq聚合酶0.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，10 μmol/L引物各0.6 μL，25 mmol/L MgCl2 1.2 μL，10×緩沖液2 μL，添加滅菌雙蒸水至20 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸 15 s，35個循環。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色檢測擴增結果。

1.6.2 基因型的確定 采用Csp6Ⅰ對PCR擴增產物進行酶切。酶切反應體系16 μL，含PCR產物4 μL，10 U/L Csp6Ⅰ0.5 μL，10×緩沖液1 μL，滅菌雙蒸水10.5 μL。37 ℃酶切 3 h。均用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，EB染色，培清JS-780全自動凝膠成像分析儀進行成像分析。CC基因型得到238 bp的1個片段，CT基因型得到80、158、238 bp等3個片段。

1.7 數據分析

對不同基因型的山羊體重體尺資料采用SPSS軟件的 Independent-Samples T Test工具進行關聯分析。

2 結果與分析

2.1 MC4R基因片段的擴增

對10只波爾山羊DNA模板分別進行MC4R基因片段PCR擴增，在1 400 bp左右得到1條特異性條帶（圖1），與預期結果一致。

2.2 測序篩選多態位點

將10只波爾山羊DNA模板擴增得到的MC4R基因片段克隆后進行測序，測序結果表明在MC4R胞內3環基因片段發現2個點突變，663 bp處C/A單堿基顛換（圖2），693 bp處C/T單堿基顛換（圖3）。經分析693 bp處C/T 變異處于Csp6Ⅰ酶切位點內。

2.3 PCR-RFLP檢測方法的建立

對163只波爾山羊樣本進行PCR擴增，在238 bp左右得

到1條特異性條帶（圖4），與預期結果一致。采用限制性內切酶Csp6Ⅰ對PCR擴增產物進行消化，結果出現2種基因型，分別命名為CC、CT。CC基因型得到238 bp 1個片段（圖5，泳道2、3）；CT基因型得到238、158、80 bp 3個片段（圖5，泳道1、4）。

2.4 MC4R基因群體遺傳學分析

2.4.1 基因型頻率在波爾山羊群體中的分布 在163只受試波爾山羊中，以CC基因型居多，占78.5%；CT基因型較少，占21.5%（表1）；C為優勢基因。

2.4.2 遺傳特性分析 由表1可見，C693T位點在波爾山羊群體中均表現為低度多態[多態信息含量（PIC）<0.25）]，而且群體遺傳雜合度較低，表明該多態位點在波爾山羊群體中的選擇潛力不大，遺傳一致性較高。

2.5 不同基因型對波爾山羊體重的影響

對受檢波爾山羊C693T位點2種基因型的山羊體重進行t檢驗，結果表明各月齡山羊體重差異均不顯著（表2）。

3 結論與討論

大量研究表明，MC4R基因在動物采食和能量平衡調控中起關鍵作用，目前已發現豬、牛、兔、犬、雞等動物的MC4R基因存在與體重性狀相關的SNPs。Kim等首次報道MC4R基因Asp298Asn突變與豬的背膘厚、生長速度、采食量顯著相關[6]。劉洪瑜等發現，牛的MC4R基因1069 C/G突變顯著影響了體斜長及胸圍[7]。蔣美山等對兔MC4R基因237 bp處A/G突變的研究顯示，該位點顯著影響兔體重、全凈膛重、飼料轉化率[8]。張軼博等發現，比格犬MC4R基因226 bp處的C/A變異與體重顯著相關[9]。仇雪梅等發現，MC4R基因5′調控區和編碼區的4個突變對雞體重、屠體性狀有顯著影響[10]。曾獻存等發現，不同MC4R基因的中國美利奴羊體斜長和腰角寬差異顯著[11]。但山羊MC4R基因多態性及其與生產性狀關聯分析未見報道。

已有研究顯示，MC4R的胞內3環對于MC4R與G蛋白的偶聯活性十分重要[12]。通過克隆測序，本研究發現波爾山羊MC4R胞內3環基因片段存在2個SNPs，即C663A、C693T，均為無義突變，不引起氨基酸的改變。其中693 bp處的C/T單堿基顛換導致產生限制性內切酶Csp6Ⅰ識別位點，據此建立了該SNP位點的PCR-RFLP檢測方法。通過對163只波爾山羊檢測發現，只檢測出2種基因型，以CC型居多，CT型較少，C為優勢基因。t檢驗表明，檢測出的2種基因型在受檢波爾山羊各月齡體重方面差異均不顯著，且該位點在波爾山羊群體中表現為低度多態（PIC<0.25），說明其在波爾山羊群體中的選擇潛力不大。但該位點在波爾山羊群體中是否均只存在2種基因型及其對體重的影響，以及C663A位點對體重、體尺性狀的影響，還須要進一步研究。

參考文獻：

[1]Yeo G S，Farooqi I S，Challis B G，et al. The role of melanocortin signalling in the control of body weight：evidence from human and murine genetic models[J]. QJM：Monthly Journal of the Association of Physicians，2000，93（1）：7-14.

[2]Sinha P S，Schioth H B，Tatro J B. Roles of the melanocortin-4 receptor in antipyretic and hyperthermic actions of centrally administered alpha-MSH[J]. Brain Research，2004，1001（1/2）：150-158.

[3]Gantz I，Miwa H，Konda Y，et al. Molecular cloning，expression，and gene localization of a fourth melanocortin receptor[J]. The Journal of Biological Chemistry，1993，268（20）：15174-15179.

[4]Huszar D，Lynch C A，Fairchild-Huntress V，et al. Targeted disruption of the melanocortin-4 receptor results in obesity in mice[J]. Cell，1997，88（1）：131-141.

[5]方曉敏，孟搖翠，任守文，等. 6個主效基因在蘇鐘豬分子育種中的應用價值[J]. 江蘇農業學報，2012，28（5）：1074-1078.

[6]Kim K S，Larsen N，Short T，et al. A missense variant of the porcine melanocortin-4 receptor （MC4R） gene is associated with fatness，growth，and feed intake traits[J]. Mammalian Genome，2000，11（2）：131-135.

[7]劉洪瑜，王 恒，任春環，等. 牛MC4R基因多態性與體尺性狀的相關分析[J]. 中國獸醫學報，2012，32（9）：1309-1311，1343.

[8]蔣美山，陳仕毅，賴松家，等. 兔黑素皮質素受體4（MC4R）基因多態性及其與體重及屠體性狀的關聯研究[J]. 遺傳，2008，30（12）：1574-1578.

[9]張軼博，巴彩鳳，蘇玉虹，等. 比格犬MC4R基因多態性與體重相關性的研究[J]. 遺傳，2006，28（10）：1224-1228.

[10]仇雪梅，李 寧，鄧學梅，等. 雞MC4R基因的SNPs及其與屠體性狀的相關研究[J]. 中國科學：C輯，2006，36（2）：127-133.

[11]曾獻存，陳韓英，賈 斌，等. MC4R和PROP1基因多態性及合并基因型與中國美利奴羊生長性狀的關聯分析[J]. 畜牧獸醫學報，2011，42（9）：1227-1232.

[12]Kim D H，Shin S W，Baik J H. Role of third intracellular loop of the melanocortin 4 receptor in the regulation of constitutive activity[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，365（3）：439-445.

2.3 PCR-RFLP檢測方法的建立

對163只波爾山羊樣本進行PCR擴增，在238 bp左右得

到1條特異性條帶（圖4），與預期結果一致。采用限制性內切酶Csp6Ⅰ對PCR擴增產物進行消化，結果出現2種基因型，分別命名為CC、CT。CC基因型得到238 bp 1個片段（圖5，泳道2、3）；CT基因型得到238、158、80 bp 3個片段（圖5，泳道1、4）。

2.4 MC4R基因群體遺傳學分析

2.4.1 基因型頻率在波爾山羊群體中的分布 在163只受試波爾山羊中，以CC基因型居多，占78.5%；CT基因型較少，占21.5%（表1）；C為優勢基因。

2.4.2 遺傳特性分析 由表1可見，C693T位點在波爾山羊群體中均表現為低度多態[多態信息含量（PIC）<0.25）]，而且群體遺傳雜合度較低，表明該多態位點在波爾山羊群體中的選擇潛力不大，遺傳一致性較高。

2.5 不同基因型對波爾山羊體重的影響

對受檢波爾山羊C693T位點2種基因型的山羊體重進行t檢驗，結果表明各月齡山羊體重差異均不顯著（表2）。

3 結論與討論

大量研究表明，MC4R基因在動物采食和能量平衡調控中起關鍵作用，目前已發現豬、牛、兔、犬、雞等動物的MC4R基因存在與體重性狀相關的SNPs。Kim等首次報道MC4R基因Asp298Asn突變與豬的背膘厚、生長速度、采食量顯著相關[6]。劉洪瑜等發現，牛的MC4R基因1069 C/G突變顯著影響了體斜長及胸圍[7]。蔣美山等對兔MC4R基因237 bp處A/G突變的研究顯示，該位點顯著影響兔體重、全凈膛重、飼料轉化率[8]。張軼博等發現，比格犬MC4R基因226 bp處的C/A變異與體重顯著相關[9]。仇雪梅等發現，MC4R基因5′調控區和編碼區的4個突變對雞體重、屠體性狀有顯著影響[10]。曾獻存等發現，不同MC4R基因的中國美利奴羊體斜長和腰角寬差異顯著[11]。但山羊MC4R基因多態性及其與生產性狀關聯分析未見報道。

已有研究顯示，MC4R的胞內3環對于MC4R與G蛋白的偶聯活性十分重要[12]。通過克隆測序，本研究發現波爾山羊MC4R胞內3環基因片段存在2個SNPs，即C663A、C693T，均為無義突變，不引起氨基酸的改變。其中693 bp處的C/T單堿基顛換導致產生限制性內切酶Csp6Ⅰ識別位點，據此建立了該SNP位點的PCR-RFLP檢測方法。通過對163只波爾山羊檢測發現，只檢測出2種基因型，以CC型居多，CT型較少，C為優勢基因。t檢驗表明，檢測出的2種基因型在受檢波爾山羊各月齡體重方面差異均不顯著，且該位點在波爾山羊群體中表現為低度多態（PIC<0.25），說明其在波爾山羊群體中的選擇潛力不大。但該位點在波爾山羊群體中是否均只存在2種基因型及其對體重的影響，以及C663A位點對體重、體尺性狀的影響，還須要進一步研究。

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[7]劉洪瑜，王 恒，任春環，等. 牛MC4R基因多態性與體尺性狀的相關分析[J]. 中國獸醫學報，2012，32（9）：1309-1311，1343.

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[11]曾獻存，陳韓英，賈 斌，等. MC4R和PROP1基因多態性及合并基因型與中國美利奴羊生長性狀的關聯分析[J]. 畜牧獸醫學報，2011，42（9）：1227-1232.

[12]Kim D H，Shin S W，Baik J H. Role of third intracellular loop of the melanocortin 4 receptor in the regulation of constitutive activity[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，365（3）：439-445.

2.3 PCR-RFLP檢測方法的建立

對163只波爾山羊樣本進行PCR擴增，在238 bp左右得

到1條特異性條帶（圖4），與預期結果一致。采用限制性內切酶Csp6Ⅰ對PCR擴增產物進行消化，結果出現2種基因型，分別命名為CC、CT。CC基因型得到238 bp 1個片段（圖5，泳道2、3）；CT基因型得到238、158、80 bp 3個片段（圖5，泳道1、4）。

2.4 MC4R基因群體遺傳學分析

2.4.1 基因型頻率在波爾山羊群體中的分布 在163只受試波爾山羊中，以CC基因型居多，占78.5%；CT基因型較少，占21.5%（表1）；C為優勢基因。

2.4.2 遺傳特性分析 由表1可見，C693T位點在波爾山羊群體中均表現為低度多態[多態信息含量（PIC）<0.25）]，而且群體遺傳雜合度較低，表明該多態位點在波爾山羊群體中的選擇潛力不大，遺傳一致性較高。

2.5 不同基因型對波爾山羊體重的影響

對受檢波爾山羊C693T位點2種基因型的山羊體重進行t檢驗，結果表明各月齡山羊體重差異均不顯著（表2）。

3 結論與討論

大量研究表明，MC4R基因在動物采食和能量平衡調控中起關鍵作用，目前已發現豬、牛、兔、犬、雞等動物的MC4R基因存在與體重性狀相關的SNPs。Kim等首次報道MC4R基因Asp298Asn突變與豬的背膘厚、生長速度、采食量顯著相關[6]。劉洪瑜等發現，牛的MC4R基因1069 C/G突變顯著影響了體斜長及胸圍[7]。蔣美山等對兔MC4R基因237 bp處A/G突變的研究顯示，該位點顯著影響兔體重、全凈膛重、飼料轉化率[8]。張軼博等發現，比格犬MC4R基因226 bp處的C/A變異與體重顯著相關[9]。仇雪梅等發現，MC4R基因5′調控區和編碼區的4個突變對雞體重、屠體性狀有顯著影響[10]。曾獻存等發現，不同MC4R基因的中國美利奴羊體斜長和腰角寬差異顯著[11]。但山羊MC4R基因多態性及其與生產性狀關聯分析未見報道。

已有研究顯示，MC4R的胞內3環對于MC4R與G蛋白的偶聯活性十分重要[12]。通過克隆測序，本研究發現波爾山羊MC4R胞內3環基因片段存在2個SNPs，即C663A、C693T，均為無義突變，不引起氨基酸的改變。其中693 bp處的C/T單堿基顛換導致產生限制性內切酶Csp6Ⅰ識別位點，據此建立了該SNP位點的PCR-RFLP檢測方法。通過對163只波爾山羊檢測發現，只檢測出2種基因型，以CC型居多，CT型較少，C為優勢基因。t檢驗表明，檢測出的2種基因型在受檢波爾山羊各月齡體重方面差異均不顯著，且該位點在波爾山羊群體中表現為低度多態（PIC<0.25），說明其在波爾山羊群體中的選擇潛力不大。但該位點在波爾山羊群體中是否均只存在2種基因型及其對體重的影響，以及C663A位點對體重、體尺性狀的影響，還須要進一步研究。

參考文獻：

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[3]Gantz I，Miwa H，Konda Y，et al. Molecular cloning，expression，and gene localization of a fourth melanocortin receptor[J]. The Journal of Biological Chemistry，1993，268（20）：15174-15179.

[4]Huszar D，Lynch C A，Fairchild-Huntress V，et al. Targeted disruption of the melanocortin-4 receptor results in obesity in mice[J]. Cell，1997，88（1）：131-141.

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[6]Kim K S，Larsen N，Short T，et al. A missense variant of the porcine melanocortin-4 receptor （MC4R） gene is associated with fatness，growth，and feed intake traits[J]. Mammalian Genome，2000，11（2）：131-135.

[7]劉洪瑜，王 恒，任春環，等. 牛MC4R基因多態性與體尺性狀的相關分析[J]. 中國獸醫學報，2012，32（9）：1309-1311，1343.

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