響應面法優化添加植物乳桿菌的益生菌發酵乳生產工藝研究

劉繼超，藥璐，姜鐵民，姜阿赤，李建濤，陳歷俊

(北京三元食品股份有限公司，北京100076)

0 引 言

發酵乳是歷史悠久的傳統產品，近年來隨著消費者對發酵乳的口味、香氣、健康和安全的不斷追求以及科學技術的發展，促進了傳統發酵乳及其制品的現代化[1]。而益生菌是一類對人體健康產生積極作用的微生物[2]，依靠其特有的療效，特別是在維持胃腸道健康方面，因此含益生菌食品越來越受到人們的關注[3]。植物乳桿菌作為益生菌的一種，能通過胃并定植于腸道發揮有益作用[4]，如免疫調節、降膽固醇等作用，此外還具有維持腸道內菌群平衡等多種功能[5]。將植物乳桿菌接種于牛乳中，發酵制成富含植物乳桿菌的發酵乳，既能保持酸奶細膩滑潤的凝乳狀態，又可提高酸奶的保健功能。因此，生產含有植物乳桿菌的益生菌產品越來越成為研究、開發、生產的焦點。

本實驗將響應面法應用到發酵乳生產工藝研究中，以發酵過程中及后熟24 h后的pH值、酸度變化結合后熟發酵乳的感官評定、活菌數、質構分析為綜合指標，優化植物乳桿菌益生菌發酵乳的生產工藝參數，得到最佳生產工藝條件，從而為實際生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus,St,St-BODY-3)，保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus,Lb,Lb340)，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum,Lp,Lp23508)，脫脂乳粉，MRS培養基。

LRH-250型生化培養箱，PB-10型pH計，自動高壓蒸汽滅菌鍋，TA-XTPlus質構儀。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化方法

將脫脂乳粉復原成質量濃度為120 g/L的脫脂乳，放置0.5 h，使蛋白質充分復水后分裝于三角瓶中，110℃滅菌10 min，冷卻至室溫，然后分別接種保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌，置于恒溫培養箱中進行凝乳培養，反復傳代至活菌數達到實驗要求。

1.2.2 酸乳生產工藝流程

脫脂乳粉120 g/L復原→滅菌(110℃，10 min)→冷卻→接菌→分裝→發酵→冷藏后熟(4℃，24 h)→成品1.2.3 檢驗方法

(1)感官評定方法。根據我國國家標準GB 19302-2010發酵乳感官評定要求，并結合質構儀測定數據對實驗所得的產品進行感官評定，評定標準如表1所示。

表1 酸乳的感官評定標準

(2)pH測定方法。采用pH計進行測定，設定測定時間為發酵結束時和后熟24 h后。

(3)酸度值測定方法。以我國國家標準GB 5413.34-2010中對酸度的測定為標準，利用濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液對發酵乳的酸度進行滴定，設定測定時間為發酵結束時和后熟24 h后。

(4)菌落計數方法。以我國國家標準GB 4789.2-2010為標準，利用平板計數法對發酵乳中活菌數進行測定，設定測定時間為發酵后熟24 h后。

(5)質構儀測試。測試模式為compression，測試前下降速度為1.0 mm/s，測試速度為1.0 mm/s，測試后速度為10.0 mm/s，測試距離為30 mm，采用A/BE探頭，直徑40 mm。

1.2.4 發酵乳工藝設計

(1)單因素實驗。在單因素試驗中，菌種配比比例依次采用1:1，1:2，1:3，1:4，2:1，3:1； 接種量依次采用2%，3%，4%，5%，6%，7%；發酵溫度依次采用33，35，37，39，41，43 ℃；發酵時間依次采用3，5，7，9，11，13 h；每個試驗均做3次平行。

(2)Box-Behnken實驗。根據Box-Behnken試驗設計原理，在單因素試驗基礎上，確定Box-Behnken設計的自變量，以菌種配比比例、接種量、發酵溫度與發酵時間為因素，感官評分為響應值，運用Design-Expert 7.0軟件對所得數據進行ANOVA分析，因素水平如表2所示。

表2 Box-Benhnken中心組合試驗因素水平編碼

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

通過感官評定、pH測定、酸度值測定、菌落計數等方法對單因素試驗菌種配比、接種量、發酵溫度以及發酵時間進行了優化分析，得到單因素試驗的最佳結果為：菌種配比(嗜熱鏈球菌+保加利亞乳桿菌)：植物乳桿菌=1：2、接種量4%、發酵溫度39℃、發酵時間7 h。

2.2 添加植物乳桿菌實驗

2.2.1 響應面分析實驗設計與結果

響應面法通過對所要優化結果的因素及交互作用進行研究，從而快速有效地確定多因子系統的最適條件[7-9]。中心組合設計(Central Composite Design,CCD)是目前較為常用的響應面分析方法[10-14]。該法可通過響應面等高線圖直觀地描繪出每個因子及其交互作用對過程的影響程度，從而得出目標值最大時的最優條件。

表3 響應面分析實驗結果

表3中， 實驗1～24為析因試驗，25～29為中心實驗。29個實驗點分為析因點與零點，其中析因點為自變量取值在A，B，C，D所構成的三維頂點，零點為區域的中心點，零點實驗重復5次，用以估計試驗誤差。

采用Design-Expert 7.0軟件對所得數據進行ANOVA分析，結果如表5所示。各因素經過擬合得到的回歸方程為：

Y=87.26-0.021A+1.21B+1.51C-0.24D+0.087AB+0.050AC-0.35AD+0.23BC+0.075BD+0.26CD-1.38A2-2.05B2-1.85C2-0.75D2。

由表4可以看出，感官評分最高的一組為第25組為87.8分，此時發酵乳硬度、稠度、凝聚性、黏 度 ， 分 別 為 171.619g，4127.621g·s，94.493g，244.817 g·s；其中凝聚性與黏度在所有中心組合實驗中均高于其他各組，硬度與稠度均適中，凝塊結實，狀態細膩均勻，發酵乳固有的滋氣味也較濃。第13組的感官評分最低為81.20分，此時發酵乳硬度、稠度、凝聚性、黏度，分別為138.764g，3566.770g·s，82.834g，249.367g·s；其凝乳不結實，而且有大量的乳清析出，可能是由于接種量與發酵溫度均較低，造成前期發酵速度緩慢。

表4 添加植物乳桿菌的益生菌發酵乳發酵后熟24 h的質構指標

表5 響應面實驗方差分析

由表5可以看出，軟件分析的模型相關系數R2=0.9777，校正決定系數R2adj=0.9553，表明該模型擬合程度較好，可根據此模型分析與預測添加植物乳桿菌的益生菌發酵乳的生產工藝參數。P＜0.0001＜0.01，表明該模型顯著，該模型的一次項B和C極顯著，A和D不顯著，二次項A，B，C，D極顯著，交叉項均不顯著。

由表6可以看出，各組后酸化能力不同，均比較弱。其中第15組與第19組的酸度值最大且為140°T，其余各組的酸度均適中，符合國家標準中規定的酸度值≥80 °T。 第7組乳酸菌活菌數最高為1.465×1010mL-1，乳酸菌活菌數最低的為第4組為7.30×107mL-1，但仍高于國家標準中規定的乳酸菌活菌數最低值1.00×106mL-1。

2.2.2 響應面直觀分析

運用Design-Expert 7.0軟件對二次回歸模型進行規范分析，考察曲面圖與等值線圖，結果如圖1～圖6所示，固定一個因素為零水平，考察兩兩因素對添加植物乳桿菌的益生菌發酵乳感官評分的影響。

圖1～圖6直觀地反映了各因素交互作用對響應值的影響，比較6組圖可知，菌種接種量(B)與發酵時間(D)、發酵溫度(C)與發酵時間(D)的交互作用較其他各組交互作用更為顯著。

表6 添加植物乳桿菌發酵后熟24 h后的各項指標測定結果

2.2.3 驗證性實驗

對回歸方程求一階偏導數可得到4個方程：

聯立方程組，解得A=0.0196，B=0.3179，C=0.4228，D=-0.0754，即添加植物乳桿菌的益生菌發酵乳的最佳生產工藝參數為A=1:2.0196，B=4.3179%，C=39.8456℃，D=6.8492 h，由回歸方程可以確定此時酸乳的感官評分最高為87.78分。

由于實驗操作的可行性，將添加植物乳桿菌的益生菌發酵乳的最佳生產工藝參數修正為：菌種配比比例為混菌(St∶Lb=1∶1)：植物乳桿菌為1∶2.02，菌種接種量4.32%，發酵溫度39.8℃，發酵時間為6.8 h，在此條件下進行3次平行試驗，結果得出發酵乳的感官評分平均為87.5分。與理論預測值基本吻合，充分驗證了所建模型的正確性，因此利用響應面分析法得到的添加植物乳桿菌的益生菌發酵乳的最佳工藝真實可靠，具有實際意義。

圖1 Y=f(A,B)的響應面圖

圖2 Y=f(A,C)的響應面

圖3 Y=f(A,D)的響應面

圖4 Y=f(B,C)的響應面

圖5 Y=f(B,D)的響應面

圖6 Y=f(C,D)的響應面

3 討 論

近年來關于對富含益生菌的發酵乳已有了一些研究，最佳工藝參數因菌種不同而異。李霞等[15]應用正交試驗方法優化出富含植物乳桿菌酸奶的最佳工藝條件為：菌種配比1∶1∶2，接種量5%，發酵溫度39 ℃，發酵時間7 h。本研究在單因素實驗的基礎上通過響應面法確定了添加植物乳桿菌的益生菌發酵乳的最佳生產工藝條件為：菌種配比比例為混菌(St∶Lb=1∶1)：植物乳桿菌為1∶2.02，菌種接種量4.32%，發酵溫度39.8℃，發酵時間為6.8 h，在此生產條件下生產的植物乳桿菌酸發酵乳組織狀態均勻細膩，酸度適中，口感醇厚柔和，氣味濃郁，感官評分達到87.5分，該實驗方法所得到的最佳生產工藝參數真實可靠，對酸乳工業化的生產有一定的指導意義。

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