含雙歧桿菌的嬰兒配方奶粉和原料中阪崎腸桿菌的檢測

姜勇，呂學娜，安玉枝，王錫青

(圣元營養(yǎng)食品有限公司，山東 青島266400)

0 引 言

雙歧桿菌 (Bifidobacterium)是人體腸道內數(shù)量最多、功能最重要的益生菌，革蘭氏陽性、無芽胞，通過定植于腸黏膜上皮細胞表面，形成一個生物學屏障，阻止和抑制各種致病菌與條件致病菌在腸道的定植、入侵和生長繁殖[1]。阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)是一種有周生鞭毛、能運動、無芽孢、兼性厭氧的革蘭氏陰性致病菌。新生兒感染該菌可導致腦膜炎、壞死性小腸結腸炎和菌血癥，感染引起的死亡率高達50%以上[2，3]。目前國家嬰兒配方食品標準GB 10765中規(guī)定阪崎腸桿菌的限量為0/100g[4]，指定的檢測方法為GB 4789.40[5]；對添加活性菌種的產(chǎn)品規(guī)定為活性益生菌數(shù)應≥106CFU/g(mL)[4]。有文獻報道益生菌對腸道致病菌有抑制作用[6，7]，其作用機理主要在于競爭性抑制或生長代謝過程中產(chǎn)生某些抑菌物質[8-10]。本研究的目的在于考察按照GB 4789.40檢測阪崎腸桿菌，雙歧桿菌的存在是否會影響檢測結果；在證實抑制作用存在后，對檢測方法進行了改進。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料A：雙歧桿菌(BI-07，1011g-1)；樣品A：嬰兒配方奶粉(添加BI-07，107g-1)；樣品B：嬰兒配方奶粉(與樣品A的差別僅在于未添加BI-07)。阪崎腸桿菌標準菌株(ATCC 51329)，緩沖蛋白胨水(BPW)，改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(mLST)，阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基，胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)，MRS培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯，萬古霉素，莫匹羅星鋰鹽。API 20 E腸桿菌和其他革蘭氏陰性桿菌鑒定系統(tǒng)。

1.2 儀器與設備

TG16-WS臺式高速離心機，BBL CrystalTMSpec比濁計，LRH-150F生化培養(yǎng)箱。

1.3 方法

1.3.1 阪崎腸桿菌的檢測

按GB 4789.40進行阪崎腸桿菌的檢測[5]，檢測程序如圖1所示。

1.3.2 雙歧桿菌的計數(shù)

按GB 4789.35進行雙歧桿菌的計數(shù)[11]。

1.3.3 標準菌懸液的制備

阪崎腸桿菌標準菌株經(jīng)復活后轉接營養(yǎng)肉湯，36℃±1℃培養(yǎng)24 h±2 h后，離心該培養(yǎng)液10 min(2 000轉/min)，棄去上清液。用10 mL無菌生理鹽水振蕩洗滌菌體，離心10 min(2 000 r/min)，棄去上清液。如此洗滌離心操作2次，再加10 mL無菌生理鹽水混勻，配制成菌懸液。用濁度計測量麥氏濁度并按GB4789.2進行計數(shù)[12]。以上操作均為無菌操作。

圖1 GB 4789.40阪崎腸桿菌檢測程序

以菌懸液濃度對相應的濁度值作圖，得菌液濃度與濁度關系曲線(圖2)。在之后的實驗中，通過測定所制備的菌懸液的濁度，從而查得菌液濃度，然后根據(jù)所需菌液濃度用無菌生理鹽水做梯度稀釋。

圖2 菌液濃度與濁度關系曲線

1.3.4 阪崎腸桿菌陽性對照的檢測

在按GB 4789.40程序進行檢測的第一步，即100 g檢樣加入900 mL BPW稀釋液的同時，加入一定量已知濃度的阪崎腸桿菌菌懸液，然后再按照后續(xù)步驟進行。

2 結果與分析

2.1 含雙歧桿菌的嬰兒配方奶粉的檢測

對表1所列檢樣進行阪崎腸桿菌的檢測。其中在樣品A阪崎腸桿菌陽性對照1和樣品B阪崎腸桿菌陽性對照1中分別加入濃度為100 mL-1的阪崎腸桿菌菌懸液1 mL，折算到檢樣中的含量分別為0.01 g-1；在樣品A阪崎腸桿菌陽性對照2和樣品B阪崎腸桿菌陽性對照2中分別加入濃度為101mL-1的阪崎腸桿菌菌懸液1 mL，折算到檢樣中的含量分別為0.10 g-1，檢測結果如表1所示。

由結果分析可知，當嬰兒配方奶粉中雙歧桿菌含量為107g-1時，可以對含量為10-2g-1的阪崎腸桿菌產(chǎn)生抑制，從而使檢測結果呈現(xiàn)假陰性；而當阪崎腸桿菌含量增至10-1g-1時，不能被完全抑制，檢測結果呈陽性。因為國家標準對嬰兒配方食品中阪崎腸桿菌的限量值為每100 g不得檢出，所以當含雙歧桿菌的嬰兒配方奶粉中，阪崎腸桿菌含量在10-2g-1水平時，按GB 4789.40進行檢測存在假陰性風險。

2.2 雙歧桿菌原料的檢測

對表2所列檢樣進行阪崎腸桿菌的檢測。因為雙歧桿菌在原料A中的含量為1011g-1，在樣品A中的含量為107g-1，按此比例計算原料A在樣品A中的添加量為1/1 000；若阪崎腸桿菌在樣品A中的含量分別為10-2g-1和10-1g-1水平，且全部來源于原料A，則其在原料A中的含量分別為102g-1和103g-1。因此在原料A阪崎腸桿菌陽性對照1和空白阪崎腸桿菌陽性對照1中分別加入104mL-1的阪崎腸桿菌菌懸液1 mL，折算到檢樣中的含量分別為102g-1；在原料A阪崎腸桿菌陽性對照2和空白阪崎腸桿菌陽性對照2中分別加入105mL-1的阪崎腸桿菌菌懸液1 mL，折算到檢樣中的含量分別為103g-1，檢測結果如表2所示。

由結果分析可知，當原料中雙歧桿菌含量為1011g-1時，可以對含量為102g-1和103g-1的阪崎腸桿菌產(chǎn)生抑制，從而使檢測結果呈現(xiàn)假陰性；而其對應的產(chǎn)品檢測結果分別為假陰性和陽性。可見采用GB 4789.40作為雙歧桿菌原料中阪崎腸桿菌的檢測方法時，也存在假陰性風險。

2.3 抑制機理研究

根據(jù)GB 4789.40檢測程序，阪崎腸桿菌的檢測過程中存在兩步增菌，第一步先用BPW(緩沖蛋白胨水)增殖腸道菌，第二步再用mLST-Vm(改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素)選擇性增殖革蘭氏陰性腸道菌，其中加入萬古霉素的作用就是選擇性抑制革蘭氏陽性菌，而雙歧桿菌是革蘭氏陽性菌，理應在此步中被抑制，因此雙歧桿菌對阪崎腸桿菌的抑制作用很有可能發(fā)生在第一步增菌過程。為驗證此推斷，在第一步增菌后，省略第二步增菌，直接劃阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基，并進行后續(xù)檢測，實驗結果如表3所示。由此可見，省略第二步增菌后的檢測結果與之前的檢測結果是一致的，證實雙歧桿菌對阪崎腸桿菌的抑制作用發(fā)生在第一步增菌過程。

表1 含雙歧桿菌的嬰兒配方奶粉的阪崎腸桿菌檢測結果 g-1

表2 含雙歧桿菌的原料的阪崎腸桿菌檢測結果 g-1

表3 省略第二步增菌后的阪崎腸桿菌檢測結果

分別對樣品A和原料A在第一步增菌前后的雙歧桿菌含量進行測定，結果如表4所示。由表中數(shù)據(jù)可以看出，雖然從微生物學角度來說雙歧桿菌并未顯著增殖，但是對于如此高濃度的初始菌含量，可以通過占優(yōu)勢的雙歧桿菌的競爭性代謝活動，迅速消耗第一步增菌培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質，從而極大程度的抑制處于弱勢的阪崎腸桿菌的生長繁殖。

表4 增菌前后雙歧桿菌的含量 mL-1

表5 方法改進后阪崎腸桿菌的檢測結果

2.4 檢測方法改進

檢測方法的改進，主要從如何抑制雙歧桿菌的生長，促進阪崎腸桿菌的增殖兩方面考慮。可以通過添加選擇性抑制劑，或增大稀釋液的用量以降低雙歧桿菌對阪崎腸桿菌的抑制作用等方法來實現(xiàn)。在第一步增菌過程中，分別考察在BPW中加入萬古霉素(終質量濃度為10 mg/L)和增大BPW稀釋液用量至1∶100；對含雙歧桿菌的嬰兒配方奶粉和原料的阪崎腸桿菌陽性對照樣品進行檢測，結果如表5所示。

由結果分析可知，在BPW中加入終質量濃度為10 mg/L萬古霉素，可以避免雙歧桿菌含量為107g-1的嬰兒配方奶粉的阪崎腸桿菌檢測結果的假陰性；而對雙歧桿菌含量為1011g-1的原料，檢測結果仍為假陰性，可能是因為雙歧桿菌含量太高所致。增大BPW稀釋液用量至1∶100，對含雙歧桿菌的嬰兒配方奶粉和原料的阪崎腸桿菌的檢測，均可避免結果的假陰性。

3 結 論

本課題的研究表明，對于含雙歧桿菌的嬰兒配方奶粉和原料，按照GB 4789.40進行阪崎腸桿菌的檢測，檢測結果存在假陰性風險。通過添加萬古霉素，或增大BPW稀釋液的用量，可以降低雙歧桿菌對阪崎腸桿菌的抑制作用，從而避免檢測結果的假陰性，保證產(chǎn)品的質量與安全。而雙歧桿菌對阪崎腸桿菌的抑制限需做進一步研究；萬古霉素的添加量、BPW稀釋液的使用量也需進一步優(yōu)化。

[1]MATSUMOTO M，BENNO Y.Consumption of Bifidobacterium lactis LKM512 yogurt reduces gut mutagenicity by increasing gut polyamine contents in healthy adult subjects[J].Mutat Res，2004，568(2)：147-153.

[2]Joint FAO/WHO Workshop on Enterobacter sakazakii and other Microorganisms in Powdered Infant Formula，Geneva，2004[C].

[3]HEALY B，COONEY S，O'BRIEN S，et al.Cronobacter(Enterobacter sakazakii)： an opportunistic foodborne pathogen [J].Foodborne Pathog Dis，2010，7(4)：339-350.

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 10765-2010食品安全國家標準 嬰兒配方食品[S].2010.

[5]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.40-2010食品安全國家標準 食品微生物學檢驗阪崎腸桿菌檢驗[S].2010.

[6]BULLEN C L，TEARLE P V，WILLIS A T.Bifidobacteria in the intestinal tract of infants： an in-vivo study[J].J Med Microbiol，1976，9(3)：325-333.

[7]趙智興.乳酸菌發(fā)酵上清液對腸道致病菌抑菌特性的研究 [D].中國農(nóng)業(yè)科學院，2006.

[8]康白.雙歧桿菌的微生態(tài)學及臨床意義 [J].中華兒科雜志，1999(05)：54-56.

[9]盧金星，張旭帆，李革，等.試管內雙歧桿菌、復方雙歧桿菌制劑對腸道致病菌的拮抗作用[J].中國微生態(tài)學雜志，1990(01)：15-18.

[10]梁冰，吳力克，姜峰，等.雙歧桿菌QJ405、乳桿菌QJ405在試管內對腸道致病菌抑殺效果的初步報告[J].中國微生態(tài)學雜志，2000(05)：25-27.

[11]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.35-2010食品安全國家標準 食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗[S].2010.

[12]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.2-2010食品安全國家標準 食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定[S].2010.