FMOC-Cl柱前衍生高效液相色譜法測定乳中慶大霉素

趙靜， 錢鐳， 劉鵬

(1.黑龍江東方學院 食品與環境工程學部，哈爾濱 150086；2.國家乳業工程技術研究中心，哈爾濱 150028)

0 引 言

慶大霉素屬于氨基糖苷類抗生素，抗菌活性強，主要作用于革蘭氏陰性菌，常用于治療細菌感染，又因其廉價易得而得到廣泛的應用[1-4]中國農業部對動物性食品中慶大霉素殘留的檢測采用的是高效液相色譜法，以OPA為衍生劑進行柱后衍生[5]，但方法的重復性較差，靈敏度較低，檢測時間較長，由于OPA本身穩定性較差[6-8]，衍生化試劑需臨時配制，且衍生產物也較易發生分解[9-11]。因此，為了方便乳及乳制品中抗生素殘留的日常監測，需要建立能夠快速測定慶大霉素的簡單的檢測方法。

本研究采用相對穩定的氯甲酸芴甲酯為衍生劑，進行柱前衍生，并對衍生條件進行了優化，旨在建立一種能同時提取并凈化原料奶中慶大霉素的前處理方法，以期建立簡單，快速的慶大霉素殘留檢測技術。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

Waters2695高效液相色譜儀，包括四元泵、自動進樣器、Empower色譜工作站，配Waters2475熒光檢測器；QL-901型振蕩器；Oasis MCX (mixed-modecation exchange)固相萃取柱；電子天平；離心機；氮吹儀；水浴鍋；酸度計等。

1.2 材料試劑

慶大霉素標物質(≥99%)：國家標準物質研究中心；乙腈(色譜純),天津科密歐公司；正己烷；庚烷磺酸鈉；氫氧化鉀；硼酸；磷酸氫二鈉；磷酸二氫鈉；氯化鈉；三氯乙酸；氯甲酸芴甲酯；甘氨酸；實驗用水均為三級水；

慶大霉素標準溶液：準確稱取慶大霉素標準品0.050mg,甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中,搖勻，配成質量濃度為1.000 g/L標準貯備溶液，使用時按需要制成相應的標準工作液。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為30℃；檢測器為熒光檢測器；激發波長為350 nm、發射波長為450 nm；流動相：乙腈-水(75:25,V/V)；流速1.0 mL/min；進樣量為10 μL。

1.3.2 樣品預處理

取慶大霉素標準溶液2 mL于指形瓶中，加入2 mL 0.4 mol/L的硼酸緩沖溶液，加入0.4 mL氯甲酸芴甲酯衍生試劑，震蕩，暗處反應30 min，加入120 μL的甘氨酸溶液終止反應，待上機分析。

1.3.3 標準曲線的制備

將慶大霉素標準儲備液，依次稀釋為5，25，50，75，100，200，500 mg/L的標準工作液， 柱前衍生化處理后，取10 μL進樣，每個標準溶液重復進樣3次，以標準溶液濃度水平為橫坐標，以待測物色譜圖的平均峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 方法的專屬性

將空白輔料溶液、標準溶液、供試品溶液按樣品預處理方法項操作，分別進樣10 μL，獲得相應的色譜圖。

1.3.5 精密度和準確度的測定

分別在同一天和連續5 d測定質量濃度為25，100，500 mg/L的慶大霉素標準工作液，每個質量濃度設5個重復，根據日內與日間變異系數評價方法的精密度和準確度。

1.3.6 穩定性實驗

慶大霉素供試品溶液經過樣品處理衍生后，每隔2 h進樣一次，每次進3針。

1.3.7 方法回收率實驗

空白輔料中加入質量濃度分別為25，100，500 mg/L的標準溶液，每一質量濃度進行 5個樣本分析，取10 μL進樣分析，獲得相應的峰面積。

1.3.8 靈敏度考察

向空白輔料中添加不同濃度的相應標準品溶液，以信噪比S/N=3時的最低質量濃度為最低檢測限，S/N=10時的最低質量濃度為最低定量。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

C18和C8色譜柱均可用于慶大霉素的檢測[12]，本實驗采用C18柱。調整流動相乙腈與水的比例發現，隨著乙腈比例的減少，慶大霉素出峰的時間會延長，出峰時間過早不利于慶大霉素殘留的充分檢出，可能會有雜質干擾，出峰時間過長，不利于快速檢測，綜合考慮，選擇乙腈與水的最優比例為75:25，不僅可以排除雜質的干擾，同時可在較短的時間內將慶大霉素檢測出來。

2.2 衍生條件的優化

本研究中對不同的衍生條件進行了單因素優化，結果發現，緩沖溶液濃度為0.4 mol/L，pH值為12.0，衍生時間30 min時，可以到達最高的響應值。

2.3 標準曲線的繪制

將稀釋以后的慶大霉素溶液，分別上機測定，以得出的峰面積的平均值為縱坐標，上機所用慶大霉素溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線如圖1所示。

圖1 慶大霉素標準曲線

2.4 方法的專屬性

在上述色譜條件下，空白、加標樣品和標準品的色譜如圖2～圖4所示。由圖4可以看出，慶大霉素的保留時間是5.18 min，圖2和圖3說明空白樣品中的物質對慶大霉素的檢測沒有干擾。

圖2 空白奶樣色譜

圖3 空白奶樣加慶大霉素標準品色譜

圖4 慶大霉素標準工作液色譜

2.5 精確度和準確度實驗

分別選取了高、中、低三個濃度梯度的慶大霉素溶液，做日內和日間準確度和精密度實驗，結果如表1所示。由表1可以看出，該方法準確度良好，精確度符合實驗要求。

2.6 穩定性實驗

慶大霉素供試溶液每隔2 h進樣一次，結果表明8 h內可獲得穩定的測定結果，相對標準偏差為2.25%，穩定性良好。

表1 慶大霉素在牛奶中的精密度和準確度

2.7 方法回收率實驗

向空白牛奶中加入標準慶大霉素溶液，使慶大霉素質量濃度為25，50，100 mg/L，并上機測定，得出方法回收率如表2所示。

表2 牛奶中慶大霉素的方法回收率

2.8 靈敏度實驗

根據信噪比(S/N)的值來確定最低定性檢測限和最低定量檢測限，結果表明該方法最低定性檢出限為0.15 mg/L，定量檢出限為0.35 mg/L。

3 討 論

本研究以乙腈與水為流動相，采用FMOC-Cl為衍生劑進行衍生，利用C18色譜柱進行分離檢測，可以較好地檢測出慶大霉素。該檢測方法中衍生條件溫和，可在室溫條件下操作，無需進行水浴加熱，降低了衍生溫度對實驗結果的影響，并且衍生物穩定性較好，時間長達8 h，同時該方法靈敏度較高，最低定量檢測限為0.35 mg/L，定性檢測限為0.15 mg/L，所以該方法更適合乳中慶大霉素的檢測。

[1]侯亞莉,朱奎,郭平,等.高效液相色譜法測定牛肌肉中慶大霉素殘留的研究[J].中國農學通報,2008,24(6):102-106.

[2]王春艷,李艷華,張秀英.檢測豬血漿中林可霉素和慶大霉素濃度的 HPLC方法的建立[J].東北農業大學學報,2011,42(12):39-44.

[3]王燕敏,崔鳳云.快速法測定硫酸慶大霉素注射液中慶大霉素含量[J].臨床醫學,2012,32(12):103-104.

[4]何維,晁若冰.硫酸慶大霉素 C組分測定方法的優化 [J].華西藥學雜志,2011,26(006):609-610.

[5]農業部1163號公告動物性食品中慶大霉素殘留檢測高效液相色譜法[S].北京:中國標準出版社,2009.

[6]KOWALCZUK D,PIETRAS R,PAW B,et al.Applying Liquid Chromatography with Fluorescence Detection to Determine Gentamicin[J].Polish Journal of Environmental Studies,2010,19(3):587-591.

[7]MANYANGA V,GRISHINA O,YUN Z,et al.Comparison of liquid chromatographic methods with direct detection for the analysis of gentamicin[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,2007,45(2):257-262.

[8]TAN X,JIANG Y,HUANG Y,et al.Persistence of gentamicin residues in milk after the intramammary treatment of lactating cows for mastitis[J].Journal of Zhejiang University SCIENCE B,2009,10(4):280-284.

[9]楊美成,劉振,嚴小蕾,等.柱前衍生化HPLC法測定硫酸慶大霉素和硫酸新霉素的含量[J].中國臨床藥學雜志,2004,13(5):288-291.

[10]關天放,黃滔敏,王東蕾,等.衍生化后紫外測定硫酸慶大霉素滴眼液中硫酸慶大霉素的含量[J].上海醫藥,2012,33(7):44-46.

[11]李瑋,胡昌勤,王明娟.高效液相色譜法測定慶大霉素 C組分的不同檢測方式測定結果的比較[J].色 譜,2007，25(4):557-561.

[12]常曉娟,彭敬東,劉紹璞,等.柱前衍生反相高效液相色譜!熒光檢測法測定大鼠血漿中的奈替米星 [J].色 譜,2009，27(6):794-798.