牛奶中蛋白酶活力測(cè)定的方法比較

楊旭，屈小玄，郭慶賀，蘭雪萍，呂遠(yuǎn)平

(四川大學(xué)食品工程系，成都 610065)

0 引 言

蛋白凝塊現(xiàn)象是牛奶儲(chǔ)存過(guò)程中較為常見(jiàn)的質(zhì)量問(wèn)題[1，2]。研究表明，蛋白凝塊是由牛奶中的蛋白酶水解乳蛋白生成肽、氨基酸所引起的[3-5]。為了控制蛋白酶引起的質(zhì)量問(wèn)題，需要對(duì)牛奶中蛋白酶活力進(jìn)行測(cè)定。

醬曲、糙米、豆粕等的蛋白酶活力測(cè)定已有成熟的方法[6-8]，而牛奶中蛋白酶活力的測(cè)定始終沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和方法。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，采用的測(cè)定方法有甲醛法[9]、鄰苯二甲醛衍生法[10]和福林試劑法[11]，但對(duì)于不同測(cè)定方法的比較卻鮮有報(bào)道。

本研究選用福林法、鄰苯二甲醛衍生法和甲醛法這三種方法對(duì)牛奶中蛋白酶活力進(jìn)行測(cè)定，評(píng)價(jià)選擇出更適合牛奶中蛋白酶活力的測(cè)定方法，為生產(chǎn)控制和產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售UHT利樂(lè)磚純牛奶；福林試劑，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，酪素(化學(xué)純)，無(wú)水碳酸鈉，三氯乙酸，十二烷基磺酸鈉(SDS)，四硼酸鈉(分析純)，鄰苯二甲醛(化學(xué)純)，-巰基乙醇(分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，LD4-2A低速離心機(jī)，HWS-26電熱恒溫水浴鍋，78HW-1恒溫磁力攪拌器，XK96-A快速混勻器，PHS-3C pH計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 福林法測(cè)定牛奶中蛋白酶活力

參考GB/T 23527-2009的方法略作修改[12]。此方法原理是蛋白酶在一定的溫度和pH下能夠水解酪素底物，產(chǎn)生含有酚基的氨基酸如酪氨酸，在堿性條件下與福林試劑反應(yīng)，生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，從而計(jì)算出蛋白酶的活力[13]。

分別取不同質(zhì)量濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0，10，20，30，40，50 mg/L)各1 mL，加入濃度為0.4 mol/L的碳酸鈉溶液5 mL，福林試劑溶液1 mL，顯色反應(yīng)在(40±0.2)℃中持續(xù)20 min。將反應(yīng)液取出后，在680 nm下測(cè)定其吸光度。根據(jù)酪氨酸不同濃度對(duì)應(yīng)的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1 mL待測(cè)牛奶樣品，加入10 g/L的酪素溶液1 mL，在(40±0.2) ℃下反應(yīng)10 min，取出靜置后過(guò)濾。再取濾液1 mL，與5 mL的碳酸鈉溶液、1 mL的福林試劑混合后，在(40±0.2) ℃下顯色20 min，于680 nm下測(cè)定其吸光度。空白組測(cè)定方法相同，只是在加入酪素之前先加入三氯乙酸使蛋白酶失活。牛奶中蛋白酶活力為

X=AK×4/10，

式中：X為牛奶樣品的蛋白酶活力(u/mL)；A為牛奶樣品的吸光度；K為吸光常數(shù)(即根據(jù)回歸方程計(jì)算出當(dāng)吸光度為1時(shí)的酪氨酸的量)；4為反應(yīng)試劑的總體積；10為反應(yīng)時(shí)間。

1.3.2 鄰苯二甲醛衍生比色法測(cè)定牛奶中蛋白酶活力

參考Church[14]和張艷[10]的方法略作修改。此方法的原理是鄰苯二甲醛衍生試劑在堿性介質(zhì)中與游離氨基酸反應(yīng)生成異吲哚衍生物，在340 nm下有特征吸收，通過(guò)測(cè)定吸光度計(jì)算出牛奶中游離氨基氮的濃度，以此反映出蛋白酶的活力。

將40 mg的鄰苯二甲醛溶于1 mL甲醇中，分別加入25 mL濃度為100 mmol/L的四硼酸鈉、2.5 mL10%的SDS、100 L的 -巰基乙醇，加水定容至50 mL，即為鄰苯二甲醛衍生試劑(OPA)。

分別取不同濃度的苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 mmol/L) 各150 μL， 加入3 mL的OPA試劑，室溫下反應(yīng)2 min，340 nm下測(cè)定其吸光度值。根據(jù)苯丙氨酸不同濃度對(duì)應(yīng)的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取10 mL待測(cè)的牛奶樣品在4 000 r/min下離心分離20 min，以脫去脂肪。取脫脂后的牛奶樣品2.5 mL，分別加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的三氯乙酸、0.5 mL蒸餾水，在2 000 r/min下離心15 min。取清液150 μL，加入3 mL的OPA試劑，室溫下反應(yīng)2 min，340 nm下測(cè)定其吸光度值。根據(jù)苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出牛奶中游離氨態(tài)氮的濃度。

1.3.3 甲醛法測(cè)定牛奶中蛋白酶活力

采用康小紅[9]的方法并進(jìn)行修改。此方法是通過(guò)測(cè)定牛奶中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度來(lái)反映蛋白酶的活力。其原理是利用了氨基酸的兩性作用，甲醛能夠固定氨基的堿性，使氨基酸的羧基顯示出酸性，通過(guò)氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定來(lái)定量，以酸度計(jì)測(cè)定滴定終點(diǎn)。

具體方法：取60 mL待測(cè)的牛奶樣品于200 mL錐形瓶中，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，用濃度為0.05 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，至pH值為8.2時(shí)記下消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，此數(shù)據(jù)可反映出牛奶中的總酸質(zhì)量濃度。加入10 mL甲醛溶液后，再用濃度為0.05 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至pH值為9.2，記下此時(shí)消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，以此計(jì)算出牛奶樣品中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度。以水為空白對(duì)照。牛奶樣品中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度按以下公式計(jì)算：

式中：X為牛奶樣品中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度；V1為牛奶中加入甲醛后消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積；V2為空白組加入甲醛后消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積；V3為牛奶樣品的取用量；c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 福林法測(cè)定牛奶中蛋白酶活力的結(jié)果

以酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)酪氨酸不同濃度所對(duì)應(yīng)的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.01043x-0.00714，R2=0.9975，式中y為吸光度，x為酪氨酸濃度。

在680 nm下測(cè)定牛奶空白對(duì)照組和試驗(yàn)組的吸光度值，根據(jù)回歸方程計(jì)算牛奶中蛋白酶活力，結(jié)果見(jiàn)表1。為了驗(yàn)證方法的重現(xiàn)性，進(jìn)行四次重現(xiàn)性試驗(yàn)，測(cè)定的牛奶中蛋白酶活力分別為1.4291，1.3905，1.4291，1.4291 u/mL，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)知識(shí)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。此方法的平均相對(duì)誤差為0.0102，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0136，說(shuō)明福林法的精確度高，數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性好。而且每次測(cè)定時(shí)同一牛奶樣品的平行值重復(fù)性好。從測(cè)定結(jié)果可以看出，反應(yīng)后牛奶吸光度的微小變化也會(huì)引起測(cè)定結(jié)果的改變，說(shuō)明此方法的靈敏性很高。向牛奶樣品中分別加入不同量的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定回收率以確定福林法的準(zhǔn)確度，結(jié)果如表3所示。福林法的回收率在96.19%～99.05%之間，平均回收率為97.54%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0120，表明福林法的準(zhǔn)確度高，符合分析標(biāo)準(zhǔn)。

表1 福林法對(duì)牛奶中蛋白酶活力的測(cè)定結(jié)果

表2 福林法測(cè)定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表3 福林法回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 鄰苯二甲醛衍生比色法測(cè)定牛奶中蛋白酶活力的結(jié)果

以苯丙氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)苯丙氨酸不同濃度所對(duì)應(yīng)的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.22387x-0.02451，R2=0.9973，式中y為吸光度，x為苯丙氨酸濃度。

在340 nm下測(cè)定經(jīng)過(guò)反應(yīng)后的牛奶的吸光度值，根據(jù)回歸方程計(jì)算牛奶中游離氨基氮的濃度，結(jié)果如表4所示。進(jìn)行了4次重現(xiàn)性驗(yàn)證，測(cè)得牛奶中蛋白酶活力分別為0.5 472，0.5 383，0.5 294，0.5 338 mmol/L。由于SDS溶解性受溫度的影響較大，不同環(huán)境溫度引起SDS溶解性變化可能是造成吸光度差異的主要原因，進(jìn)而對(duì)牛奶中蛋白酶活力的測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(表5)得出此方法的平均相對(duì)誤差為0.0104，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0142，說(shuō)明鄰苯二甲醛衍生比色法也具有較高的精確度，結(jié)果重現(xiàn)性較好。每次測(cè)定時(shí)同一牛奶樣品的平行值重復(fù)性好。從試驗(yàn)結(jié)果分析，吸光度的微小變化同樣會(huì)引起所測(cè)蛋白酶活力的變化，說(shuō)明此方法的靈敏度也很高。向牛奶樣品中分別加入不同量的苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定回收率以確定鄰苯二甲醛衍生比色法的準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表6。鄰苯二甲醛衍生比色法的回收率在94.88%～98.70%之間，平均回收率為96.33%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0173，表明此方法的準(zhǔn)確度高，同樣符合分析標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 甲醛法測(cè)定牛奶中蛋白酶活力的結(jié)果

用濃度為0.005 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，分別測(cè)定原樣品和加入甲醛后的樣品消耗氫氧化鈉的量，以此計(jì)算出牛奶中蛋白酶的活力，測(cè)定結(jié)果如表7所示。從重現(xiàn)性驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，甲醛法結(jié)果重現(xiàn)性較差，4次測(cè)定的氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度分別為0.0 308，0.0 325，0.0 333，0.0 306 g/100 mL，且每次滴定時(shí)同一牛奶樣品消耗氫氧化鈉的平行值差異較大。表8為四次重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)，此方法的平均相對(duì)誤差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.1 407和0.040 9，表明相較于福林法和鄰苯二甲醛衍生比色法，甲醛法的精確度明顯較低。向牛奶樣品中分別加入不同量的苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定回收率以確定甲醛法的準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表9。甲醛法的回收率在88.84%～100.25%之間，平均回收率為95.23%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0497，說(shuō)明此方法較前兩種方法的準(zhǔn)確度低。

表4 鄰苯二甲醛衍生比色法對(duì)牛奶中蛋白酶活力的測(cè)定結(jié)果

表5 鄰苯二甲醛衍生比色法測(cè)定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表6 鄰苯二甲醛衍生比色法回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 甲醛法對(duì)牛奶中蛋白酶活力的測(cè)定結(jié)果

表8 甲醛法測(cè)定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表9 甲醛法回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 3種測(cè)定方法的比較

從測(cè)定原理來(lái)看，福林法、鄰苯二甲醛衍生比色法和甲醛法這3種測(cè)定蛋白酶活力的方法都是以測(cè)定產(chǎn)物氨基酸的量來(lái)表示蛋白酶活力。但是，福林法是對(duì)蛋白酶分解酪素產(chǎn)生的含有酚基的氨基酸進(jìn)行測(cè)定，以酪氨酸的量來(lái)表示牛奶中氨基酸的量，鄰苯二甲醛比色法是通過(guò)對(duì)與鄰苯二甲醛衍生試劑反應(yīng)的游離氨基酸進(jìn)行測(cè)定，以苯丙氨酸的量來(lái)表示牛奶中氨基酸的量，甲醛法則是通過(guò)消耗堿液的量來(lái)測(cè)定氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度，以氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度來(lái)表示牛奶中氨基酸的量。3種測(cè)定方法和表達(dá)方式有所不同，但福林法從原理上能夠更為實(shí)際地反映出牛奶中蛋白酶的活力。

從檢測(cè)過(guò)程來(lái)看，福林法反應(yīng)條件苛刻，試劑大多需要現(xiàn)配現(xiàn)用，操作復(fù)雜；鄰苯二甲醛衍生比色法反應(yīng)時(shí)間最短，操作較甲醛法稍顯復(fù)雜，測(cè)定過(guò)程中溫度對(duì)SDS溶解性影響較大，SDS的溶解性對(duì)吸光度又有直接影響，因而在測(cè)定中對(duì)溫度的控制增加了操作的復(fù)雜性；甲醛法是3種方法中操作最為簡(jiǎn)便的，反應(yīng)時(shí)間適中。

從測(cè)定結(jié)果來(lái)看，福林法精確度和準(zhǔn)確度高，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中結(jié)果重現(xiàn)性好；鄰苯二甲醛衍生比色法精確度和準(zhǔn)確度也高，3次重復(fù)試驗(yàn)中結(jié)果重現(xiàn)性較福林法較差，這可能是由于測(cè)定中環(huán)境的溫度變化引起吸光度的差異；甲醛法精確度和準(zhǔn)確度均較低，3次重復(fù)試驗(yàn)中結(jié)果重現(xiàn)性較差。將3種方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較分析，其所測(cè)得牛奶中蛋白酶活力的表達(dá)方式不同，福林法得到的酶活力單位為u/mL，鄰苯二甲醛法得到的酶活力是以每升牛奶中游離氨基氮的毫摩數(shù)來(lái)表示，而甲醛法測(cè)得的酶活力是以100 mL牛奶中氨基酸態(tài)氮的克數(shù)來(lái)表示，很難直接進(jìn)行數(shù)值比較。因此，對(duì)牛奶樣品進(jìn)行稀釋，分別用3種方法測(cè)定稀釋后牛奶的蛋白酶活力，結(jié)果如表10所示。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的相關(guān)分析(t檢驗(yàn)：成對(duì)雙樣品均值分析)對(duì)三組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，福林法和鄰苯二甲醛衍生比色法測(cè)定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.986，福林法和甲醛法測(cè)定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.956，鄰苯二甲醛衍生比色法和甲醛法測(cè)定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.983，表明3種方法的變化趨勢(shì)是一樣的，都可以從不同角度反映出牛奶中蛋白酶的活力，結(jié)果之間可以進(jìn)行比較客觀的比較。

表10 3種方法對(duì)不同濃度的牛奶中蛋白酶活力的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié) 論

試驗(yàn)對(duì)福林法、鄰苯二甲醛衍生比色法和甲醛法這3種測(cè)定牛奶中蛋白酶活力的方法進(jìn)行比較，從相關(guān)性結(jié)果來(lái)看，3種方法均能從不同角度反映出牛奶中蛋白酶活力。福林法雖然操作復(fù)雜，但其測(cè)定結(jié)果能夠直接客觀的反應(yīng)出牛奶中蛋白酶活力，精確度、準(zhǔn)確度和靈敏度高，重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性好，適合于牛奶中蛋白酶活力的精密測(cè)定；鄰苯二甲醛衍生比色法測(cè)定的蛋白酶活力是以1 L牛奶中游離氨態(tài)氮的毫摩數(shù)來(lái)表示，精確度和準(zhǔn)確度好，靈敏度高，反應(yīng)時(shí)間短，但測(cè)定過(guò)程中由溫度引起的SDS溶解性問(wèn)題對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大，適合于不同樣品間蛋白酶活力的精確比較；甲醛法是以100 mL牛奶中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量來(lái)表征蛋白酶活力的，操作簡(jiǎn)單，但是準(zhǔn)確性和精確度都較低，重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)結(jié)果的重現(xiàn)性不好，適合于粗略性和比較性測(cè)定。

[1]生慶海，張愛(ài)霞.UHT乳貯存，問(wèn)題及其原因分析[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2002(5)：14.

[2]閆志國(guó).UHT乳生產(chǎn)工藝及其在貯藏期間理化性質(zhì)的變化[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2011(3)：114-117.

[3]于維軍，王瑞強(qiáng)，趙慶江.超高溫滅菌乳的主要質(zhì)量問(wèn)題及控制措施[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2006，34(6)：55-57.

[4]付文菊.嗜冷菌及其耐熱性酶對(duì)乳制品品質(zhì)的影響[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2009(9)：78-80.

[5]王輝，呂加平，劉鷺.耐熱蛋白酶對(duì)UHT乳蛋白的水解作用[J].食品科學(xué)，2010，31(17)：228-231.

[6]李存富.醬曲蛋白酶活力測(cè)定-氨基氮法[J].中國(guó)調(diào)味品，2006(3)：48-49.

[7]魯紅俠，杜先鋒，陳文幫，等.糙米發(fā)芽過(guò)程中蛋白酶活力動(dòng)態(tài)變化研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34(10)：272-276.

[8]吳輝，卓林霞，解檢清，等.發(fā)酵條件對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕中的蛋白酶活力的影響[J].現(xiàn)代食品科技，2008，24(10)：973-976.

[9]康小紅，孫國(guó)慶，付治軍，等.UHT牛奶蛋白凝塊產(chǎn)生原因及控制措施的研究[J].食品工業(yè)科技，2008，29(5)：165-167.

[10]張艷，郭利春，郭奇慧，等.UHT乳結(jié)塊原因分析[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28(12)：84-86.

[11]袁瑋，胡海蓉，趙懷根，等.鮮牛乳中乳桿菌的檢測(cè)及脂肪酶、蛋白酶測(cè)定方法的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2000，27(6)：35-38.

[12]中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì).GB/T 23527—2009中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)書(shū)號(hào)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

[13]鄭玉才.加熱和磁處理對(duì)牛奶中酶活力及蛋白組成的影響[J].中國(guó)乳品工業(yè)，1994，22(4)：171-172.

[14]CHURCH F C，SWAISGOOD H E，Porter D H，et al.Spectrophotometric assay using o-phthaldialdehyde for determination proteolysis in milk and isolated milk proteins[J].Dairy Sci.，1983，66(6)：1219-1227.