IAC-HPLC法檢測(cè)牛奶中黃曲霉毒素和玉米赤霉醇及類似物質(zhì)量分?jǐn)?shù)

王昕，姚佳，果旗，里南，江帆，王雄，張建新

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.北京中檢維康技術(shù)有限公司，北京 100044)

0 引 言

黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2， 加上2種代謝物M1、M2可以直接污染食品和飼料，對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織有破壞作用，嚴(yán)重時(shí)，可導(dǎo)致肝癌甚至死亡[1]。

玉米赤霉醇是玉米赤霉菌在生長(zhǎng)過程中的次生代謝產(chǎn)物[2]。α-玉米赤霉醇及類似物都屬于雷索算內(nèi)酯類藥物[3]。玉米赤霉醇曾作為反芻動(dòng)物家畜牛羊的生長(zhǎng)促進(jìn)劑，但后來研究表明，其在動(dòng)物組織中的殘留會(huì)影響人體健康，甚至在外部條件誘導(dǎo)下，具有致癌作用[4-5]。

目前針對(duì)這兩大類物質(zhì)的檢測(cè)方法主要有HPLC(高效液相色譜法)、TLC (薄層層析法)、LC-MS/MS(液質(zhì)聯(lián)用)及ELISA(酶聯(lián)免疫)法[6-9]。 其中ELISA法使用較為普遍，但該方法定量誤差較大，僅可作為陽(yáng)性樣品的初篩工具[10]，目前針對(duì)這兩大類物質(zhì)多采用單獨(dú)分析方法來定量[11-14]。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑

甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，去離子水，黃曲霉毒素(標(biāo)準(zhǔn)品)，玉米赤霉醇類(標(biāo)準(zhǔn)品)；黃曲霉毒素玉米赤霉醇復(fù)合免疫親和柱(AZ復(fù)合免疫親和柱)。

1.2 儀器

L-2485型高效液相色譜儀帶熒光檢測(cè)器，SPD-10A型高效液相色譜儀帶紫外檢測(cè)器，光化學(xué)衍生器，800D型離心機(jī)，泵流操作架，DCY-12S型氮吹儀，微型渦旋混合器。

1.3 方法

1.3.1 去脂

量取牛奶樣品60 mL，將樣液移入2個(gè)50 mL離心管中以4 000 r/min離心15 min，去除上層脂肪備用。

1.3.2 富集和凈化

將免疫親和柱置于泵流操作架上，取50.0 mL去脂奶以1滴/s的流速全部通過AZ復(fù)合親和柱，待溶液全部流出后，用10.0 mL純水以1～2滴/s的流速淋洗親和柱，待純水全部流出后，取干凈玻璃小管置于親和柱下，用2.0 mL甲醇以1滴/s淋洗親和柱，將所有樣品淋洗液收集于玻璃小管中，于50℃氮?dú)庀麓蹈桑缓笥皿w積比為50∶50的甲醇水定容至500 μL。黃曲霉毒素按照HPLC-熒光檢測(cè)條件檢測(cè)，玉米赤霉醇及其類似物按照HPLC-UV檢測(cè)條件進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品配制

黃曲霉毒素6種標(biāo)準(zhǔn)品的配置與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：6種混合標(biāo)準(zhǔn)品用50%的甲醇配制，質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μg/L，供液相色譜檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

玉米赤霉醇及其類似物6種標(biāo)準(zhǔn)品的配置與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：6種混合標(biāo)準(zhǔn)品用50%甲醇配制，質(zhì)量濃度分別為3.125，6.25，12.5，25，50 μg/L，供液相色譜檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4 色譜條件

(1)HPLC-熒光條件。Cloversil-C18柱 子 (4.6 mm×250 mm，5 um)；流動(dòng)相為V(水)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=11∶4∶5；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器；激發(fā)波長(zhǎng)355 nm，發(fā)射波長(zhǎng)430 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

(2)HPLC-UV 條件。 色譜柱：Cloversil-C18柱子(4.6 mm×250 mm，5 um)；流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=40∶5∶55；流速為1.0 mL/min；柱溫為室溫；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；波長(zhǎng)265 nm；進(jìn)樣量50 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的選擇

2.1.1 提取方法的選擇

黃曲霉毒素和玉米赤霉醇類的檢測(cè)，通常采用有機(jī)溶劑甲醇、乙腈等作為提取劑，鑒于本試驗(yàn)中牛奶樣品液態(tài)、體系均勻的特殊形態(tài)，嘗試樣品直接過柱的方法。結(jié)果表明，直接過柱的方法，六種黃曲霉毒素的回收率均在90%以上，玉米赤霉醇及其類似物的回收率相對(duì)較低，但結(jié)果穩(wěn)定，綜合考慮試驗(yàn)的回收率結(jié)果和試驗(yàn)操作的簡(jiǎn)便性，采用直接過柱的方法。

2.1.2 免疫親和柱凈化條件的優(yōu)化

當(dāng)淋洗液為10 mL時(shí)，雜質(zhì)基本可以去除，6種黃曲霉毒素和6種玉米赤霉醇及其類似物均未被洗脫下來。隨著洗脫液甲醇的用量增加，回收率提高，當(dāng)體積大2 mL時(shí)，12種物質(zhì)的回收率趨于穩(wěn)定。因此，本法采用10 mL水作為淋洗液，2 mL甲醇作為洗脫液。

2.2 色譜條件的選擇

6種黃曲霉毒素，采用Cloversil-C18柱子(4.6 mm×250 mm，5 um)色譜柱進(jìn)行分離，以V(水)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=11∶4∶5為流動(dòng)相，激發(fā)波長(zhǎng)355 nm，發(fā)射波長(zhǎng)430 nm下熒光檢測(cè)。6種玉米赤霉醇及其類似物，采用loversil-C18柱子(4.6 mm×250 mm，5 um)；以V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=40∶5∶55為流動(dòng)相，波長(zhǎng)265 nm下紫外檢測(cè) 。在這兩種檢測(cè)條件下，所得色譜圖的保留時(shí)間、峰形及峰高均能滿足要求。 圖1為AFM2，AFM1，AFG2，AFG1，AFB2，AFB1質(zhì)量濃度分別為5.0，5.6，1.6，5.8，1.7，5.7 μg/L的色譜；，圖2為6種玉米赤霉醇及其類似物的質(zhì)量濃度為均為50.0 μg/L的色譜。

圖1 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)色譜

圖2 玉米赤霉醇類標(biāo)準(zhǔn)色譜

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 線性范圍和檢測(cè)限

分別配置質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μg/L黃曲霉毒素系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，6種黃曲霉毒素均呈良好線性關(guān)系(見表1)，以信噪比(S/N≥3)為方法檢測(cè)限，黃曲霉毒素M2，M1，G2，G1，B2，B1的檢測(cè)限分別為0.4，0.4，0.4，0.3，0.2，0.2 μg/L，牛奶樣品濃縮了100倍，所以樣品中黃曲霉毒素M2，M1，G2，G1，B2，B1的檢出限分別為0.004，0.004，0.004，0.003，0.002 ，0.002 μg/L。 分別配置質(zhì)量濃度分別為3.125，6.25，12.50，25.0，50.0 μg/L的玉米赤霉醇及其類似物系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，6種物質(zhì)均呈良好線性關(guān)系(見表2)，以信噪比為(S/N≥3)為方法檢測(cè)限，玉米赤霉醇及其類似物液相色譜的方法檢測(cè)限為5 μg/L，牛奶樣品濃縮了100倍，所以樣品中玉米赤霉醇及其類似物的檢測(cè)限為0.05 μg/L。本法靈敏度高。

2.3.2 方法的回收率和精密度

選擇市面上普通的純牛奶添加黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品和玉米赤霉醇類標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行樣品處理，測(cè)定回收率；分別取5份牛奶按1.3方法處理后上機(jī)檢測(cè)，測(cè)定方法精密度。黃曲霉毒素的平均添加回收率在91.20%～113.8%之間，RSD值在4.53%～8.79%之間。玉米赤霉醇類的平均添加回收率在54.22%～90.76之間，RSD值在1.90%～9.44%之間(見表3～表6)。

表1 黃曲霉毒素線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)

表2 玉米赤霉醇類線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)

表3 樣品中黃曲霉毒素回收率的測(cè)定結(jié)果

表4 樣品中黃曲霉毒素精密度測(cè)定結(jié)果

表5 樣品中玉米赤霉醇及其類似物回收率測(cè)定結(jié)果

表6 樣品中玉米赤霉醇及其類似物精密度的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié) 論

免疫親和柱中的抗體能對(duì)目的檢測(cè)物進(jìn)行特異性吸附，雜質(zhì)影響小，專一性強(qiáng)，復(fù)合柱更使得多種物質(zhì)可以同時(shí)凈化，本試驗(yàn)采用AZ復(fù)合免疫親和柱對(duì)樣品進(jìn)行一次性凈化，再在不同條件下分別檢測(cè)黃曲霉毒素和玉米赤霉醇及其類似物含量，樣品只需經(jīng)過一次性前處理，簡(jiǎn)單高效。 黃曲霉毒素M2，M1，G2，G1，B2，B1的檢測(cè)限分別為0.004， 0.004， 0.004， 0.003， 0.002，0.002 μg/L，平均加標(biāo)回收率在91.20%～113.8%之間，變異系數(shù)小于8.79%；玉米赤霉醇及其類似物的檢測(cè)限均為0.05 μg/L，平均回收率在54.22%～90.76%之間，變異系數(shù)小于9.44%。所得結(jié)果均在可接受范圍內(nèi)，該方法適用于牛奶中黃曲霉毒素和玉米赤霉醇及其類似物的快速檢測(cè)。

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