奶牛不同發育時期乳腺組織IGF-I及其受體的表達與定位

崔英俊，李慶章

(東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030)

0 引 言

胰島素樣生長因子家族(Insulin-like growth factor family)是乳腺生長發育的重要調節因子。成熟IGF-I由70個氨基酸殘基組成，相對分子質量約7.5 ku，是生長激素 (Growth factor，GH) 依賴的堿性單鏈蛋白[1]。IGF-I主要由垂體GH刺激肝產生，GH也可以刺激乳腺分泌IGF-I，并通過IGF-I對乳腺發育起作用。IGFI作于乳腺上皮細胞上的IGF-IR從而介導細胞的生存和增殖[2-3]，IGF-I缺失時乳腺不發育[4]。目前國內外對胰島素樣生長因子家族成員的研究多以嚙齒類動物為研究對象，且多局限于RNA水平。本研究旨在闡述IGF-I及其受體IGF-IR在奶牛乳腺發育、泌乳及退化過程中表達定位的動態變化，揭示IGF-I及其受體表達變化與乳腺發育及泌乳功能的關系。

1 實 驗

1.1 實驗動物與樣品采集

本研究以健康荷斯坦奶牛為實驗動物，購自黑龍江省畜牧業科技園區。所選用的奶牛生理狀態均正常，沒有疾病記錄，泌乳期奶牛乳腺健康，產奶量正常。奶牛舍飼，舍溫18℃，通風干燥，采光良好，自由采食飲水。

實驗動物按照青春期(Virgin，V)、妊娠期(Pregnancy，P)、泌乳期(Lactation，L)、退化期(Involution，I)4個時期共12個時點進行取樣。分別為：青春期12個月(V12m)、青春期14個月(V14m)；妊娠期2個月(P2m)、妊娠期4個月(P4m)、妊娠期6個月(P6m)；圍產前期(產前7日，Peripartum)；泌乳期第7日(L7d)，泌乳期第50日(L50d)，泌乳期第140日(L140d)，泌乳期第280日(L280d)；退化期第3日(I3d)，退化期第30日(I30d)。 每個采樣時點選取3頭奶牛做平行實驗，每次試驗至少重復3次。在預定取樣時點，乳房中部消毒，按常規手術切取少量乳腺組織塊，獲取組織樣本。獲取的組織樣本在30 min內于液氮速凍，保存于-80℃低溫冰箱備用。

1.2 主要試劑

兔抗IGF-I多克隆抗體 (H-70)(sc-9013)， 兔抗IGF-I Rβ多克隆抗體(3027)，鼠抗β-actin抗體(C-14)(sc-47778)，FITC-羊抗兔IgG(sc-2012)，HRP-雞抗兔IgG，HRP-雞抗鼠IgG，正常山羊血清封閉液，DAPI (4，6-聯脒-2-苯基吲哚)，TritonX-100，DABCO(1，4-重氮基雙環[2，2，2]辛烷)，BCA蛋白濃度測定試劑盒，RIPA蛋白裂解液 (P0013B)，ECL超敏化學發光液，Tricine(三[羥甲基]甲基甘氨酸)。其他試劑均為市售分析純試劑。

1.3 方法

1.3.1 免疫熒光檢測

厚度8 m的冰凍切片復溫后置于預冷丙酮，4℃固定10 min，PBS漂洗3次。體積分數10%的山羊血清 37℃封閉2 h，再加入一抗(1:50)(陰性對照加等量PBS)，4 ℃過夜。次日PBS漂洗3 次，FITC-羊抗兔IgG(1∶100)37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3次。 DAPI(10 mg/L)染液室溫染核5 min，PBS漂洗3次，DABCO封片。激光掃描共聚焦顯微鏡 (Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM)進行掃描拍照(400×)。

1.3.2 蛋白提取及Western blotting分析

稱取100 mg奶牛乳腺組織樣本剪碎后，于玻璃勻漿器中加入1 mLRIPA蛋白裂解液(PMSF終濃度為1 mmol/L)，冰上勻漿；充分裂解后，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，取上清，即為總蛋白；用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。

蛋白樣品調至等濃度，與2×上樣緩沖液1:1混合，煮沸10 min，冷卻后50 μg/孔上樣，分別用8%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)分離IGF-IRβ，用16%Tricine-SDS-PAGE分離IGF-I，電泳結束后用半干轉移電泳法將蛋白轉至硝酸纖維素膜 (NC膜)。TBS洗滌NC膜10 min；將其放入適量50 g/L(質量濃度)脫脂乳封閉液(TBS/T配制)中，37℃孵育1.5 h，一抗(兔抗IGF-I多克隆抗體1∶1000稀釋、兔抗IGF-I Rβ多克隆抗體1∶1000稀釋，鼠抗β-actin抗體，1∶500稀釋)4℃孵育過夜。TBS/T洗膜3次，每次5 min，二抗(HRP-山羊抗兔IgG 1∶10 000稀釋、HRP-雞抗鼠IgG 1∶1 000稀釋)孵育，室溫1 h，洗膜后用ECL超敏發光液孵育，X射線膠片壓片、顯影、定影，透射掃描儀掃描X光片。

1.3.3 數據處理和統計分析

Western blotting結果用Bandscan 5.0軟件分析。所得數據均以平均數±標準差表示，同一樣本不同處理的結果用SPSS 16.0統計分析軟件進行t檢驗，多組數據之間應用Duncan檢驗。P＜0.05為統計學差異有顯著性。

2 結 果

2.1 乳腺IGF-I及IGF-IR的定位

青春期奶牛乳腺發育的主要特征是導管發育。在發育良好的脂肪組織周圍可見小團的導管。在導管腔上線狀排列著一個兩層上皮組織，它由近似方形的腔分泌細胞組成；導管腔上還有一個由肌上皮細胞組成的基底層。在導管間，圍繞著導管上皮有一個3～4層的疏松結締組織。IGF-I定位于青春期乳腺導管腔上皮細胞以及基質中(圖1a)。IGF-IR顯示了與IGF-I類似的定位(圖1f)。

妊娠2個月時奶牛乳腺內導管分支大量增殖，腺泡芽大量形成；妊娠4個月至妊娠6個月，乳腺腺泡大小不一、形態各異，腺泡腔逐步擴大；圍產期時大量的小葉腺泡發育完全，小葉間和腺葉間的結締組織隔膜都伸長和變薄。IGF-I在圍產期(圖1c)、IGF-IR在妊娠期6個月表達較弱；在妊娠期的其他檢測時點，IGFI與IGF-IR均定位于妊娠期乳腺導管腔上皮細胞、乳腺腺泡上皮細胞，以及基質中(圖1b，圖1 g～h)。

泌乳期乳腺小葉由大量具有張開腔結構的腺泡組成，這些腔狀結構間被結締組織分隔。在泌乳期，IGF-I與IGF-IR均定位于泌乳期乳腺腺泡上皮細胞以及基質中(圖1d，圖1i)。

退化30d，IGF-I與IGF-IR均微弱定位于小葉間基質(圖1e，圖1j)。

圖1 奶牛不同發育時期乳腺IGF-I及IGF-IR的定位

2.2 乳腺IGF-I及IGF-IR的蛋白表達變化

奶牛不同發育時期乳腺IGF-I及IGF-IR的蛋白表達變化分別如圖2和圖3所示。

圖2 奶牛不同發育時期乳腺IGF-I蛋白表達變化

圖3 奶牛不同發育時期乳腺IGF-IR蛋白表達變化

將Western blotting結果掃描，用Bandscan5.0軟件進行灰度統計和分析，奶牛不同發育時期乳腺IGF-I及IGF-IR蛋白的相對表達量如圖4所示。

圖4 奶牛不同發育時期乳腺IGF-I及IGF-IR蛋白的相對表達量

IGF-I在V12m時蛋白表達量較高，隨后在V14m表達量顯著下降(P＜0.05)；進入妊娠期，隨乳腺發育IGF-I表達量持續下降，至圍產前期達到最低值(P＜0.05)； 在泌乳期初期L7d，IGF-I表達量顯著高于圍產期(P＜0.05)，隨后在泌乳期各檢測時點IGF-I表達量持續升高，在L140d達到最大值(P＜0.05)，然后在L280d顯著下降(P＜0.05)；進入退化期，IGF-I表達量繼續下降，在I30d檢測不到其蛋白表達(圖4a)。

在青春期時IGF-IR蛋白表達量沒有顯著性差異(P＞0.05)；在妊娠初期(P2m)和中期(P4m)，IGF-IR表達量顯著升高(P＜0.05)，隨后在P6m表達量突然顯著下降(P＜0.05)；在圍產前期IGF-IR表達量有一個顯著且突然的升高，并達到最大值(P＜0.05)；進入泌乳期，IGF-IR表達量保持持續而顯著的下降(P＜0.05)，這種下降一直維持到退化期；在退化期的2個檢測時點，IGF-IR表達量持續下降但并無顯著性差異(P＞0.05)，在I30達到最小值(圖4b)。

3 討 論

在乳腺中IGF-I由與乳腺相關聯的基質細胞(如成纖維細胞以及脂肪細胞)合成，脂肪細胞對IGF-I的釋放可被葡萄糖和脂肪酸調節[5]。IGF-I的主要生理學作用是刺激出生后身體生長[6]，調節全身蛋白合成，調節組織周圍的葡萄糖攝取和脂質代謝，以及細胞增殖[7-8]。在乳腺組織中，IGF-I與乳腺發育有關，能促進乳腺上皮細胞增殖，抑制其凋亡[9-10]。在泌乳晚期，IGF-I可能維持乳腺細胞數量，而不是直接刺激乳合成[11-13]。本研究結果表明，IGF-I蛋白表達量在泌乳期各檢測時點持續升高，在L140d達到最大值，然后在L280d顯著下降；這說明在乳汁形成及乳汁分泌過程中，局部IGF-I作用強。在泌乳晚期IGF-I蛋白表達下降，則可能是乳腺即將進入退化期內在調控的結果。

在小鼠青春期以及妊娠期誘導的乳腺發育過程中，IGF-IR在整個乳腺上皮組織表達。IGF-IR也在正常人乳腺組織表達[14-15]。IGF-IR對于正常青春期乳腺導管分枝以及末端乳芽增殖不可缺少[16]。Rowzee等(2009)研究結果表明，小鼠乳腺上皮細胞中的IGF-IR mRNA表達在妊娠早期達到峰值并在妊娠晚期下降[17]，這與本研究中青春期及妊娠期IGF-IR的蛋白表達規律基本一致。有研究表明IGFs的存在對分化有抑制作用。因此妊娠末期乳腺上皮細胞中IGF-IR下降，可能與減慢生長，給細胞分化多提供一些機會有關。

牛乳腺組織在泌乳期基本都是由上皮細胞組成[18]，因此IGF-IR在泌乳期表達量隨乳生成呈現變化可能是上皮細胞數量改變的結果。本研究結果表明，進入泌乳期IGF-IR蛋白表達量持續下降；結合本研究泌乳期IGF-I蛋白表達先升后降的結果，說明在奶牛乳腺中IGF-I與IGF-IR結合并發揮作用時，可能還涉及其他的調控方式。

在奶牛不同發育時期，IGF-I和IGF-IR在奶牛乳腺中定位的一致性及其特異性表達規律，預示二者結合并參與了奶牛乳腺發育及泌乳的調控。IGF家族還有許多重要成員，各自具有復雜的生理功能。因此，奶牛不同發育時期乳腺中其他IGF家族成員的蛋白表達規律及彼此間的相互作用還有待深入研究。

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