響應面法優化紫云英根瘤菌發酵條件

呂黎等

摘要：在搖瓶培養條件下，采用響應面法對紫云英根瘤菌的發酵條件進行優化。以單因素試驗確定的蔗糖濃度、酵母膏濃度、初始pH值為自變量，以根瘤菌活菌數為響應值，利用Box-Behnken試驗設計原理及Design Expert 8.0軟件進行回歸分析，得到紫云英根瘤菌最佳發酵條件，即蔗糖濃度2.19%，酵母膏濃度0.9%，初始pH值 6.89，該條件下，根瘤菌活菌數為20.533億CFU/mL。通過3次平行試驗驗證表明，在優化后的發酵條件下根瘤菌活菌數實測值為20.497億CFU/mL，與預測值相對誤差為0.2%，表明模型擬合效果良好。

關鍵詞：響應面法；紫云英根瘤菌；發酵條件

中圖分類號： S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0323-03

收稿日期：2013-08-27

基金項目：湖南省長沙市科技計劃（編號：K1308090-21）。

作者簡介：呂黎（1985—），女，河南信陽人，碩士，實習工程師，從事微生物工程和菌株遺傳改良研究。Tel：（0731）83285950；E-mail：ll-137@163.com。

通信作者：豐來，碩士，助理工程師，從事微生物工程與酶制劑研究。E-mail：fenglai@taigubio.com。紫云英別稱翹搖、紅花草等，是一種能形成共生固氮體系的豆科植物[1]。在我國水稻種植區，紫云英作為稻田綠肥，具有改善土壤理化性狀、平衡土壤生態環境、促進土壤有機碳積累、提高作物產量和品質等重要作用[2-3]。此外，紫云英還具有較高的食用、飼用價值。美國、日本、韓國等發達國家正在大力發展紫云英產業[4]。近年來隨著耕地質量下降，肥料利用率降低，土壤、水源污染嚴重，農產品品質下降，紫云英種植在我國逐漸引起重視[5]。與大豆、花生等豆科植物一樣，種植紫云英時須要根瘤菌形成共生固氮體系，以促進生產和保證產量。經研究發現，接種根瘤菌可顯著提高紫云英結瘤率，提高紫云英總苗數、株高、單株分枝數、單株鮮重等生長指標，使其產量增加11%～17%，效果顯著[6-7]。在初次種植紫云英的土壤中接種有效根瘤菌是決定其產量的重要因素，在多年連作地區接種優良菌株也能促進增產[8]。目前，市場上紫云英根瘤菌菌劑產品類型和有效活菌數少，不能有效滿足當前紫云英產業的發展。本研究采用響應曲面法對紫云英根瘤菌發酵條件進行優化，以確定最佳發酵組合，以期為紫云英根瘤菌菌劑的高密度、大規模發酵生產提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株紫云英根瘤菌（Rhizobium astragali）菌株ACCC 13004。

1.1.2培養基YMA液體培養基：10 g/L甘露醇、3 g/L酵母膏、0.5 g/L K2HPO4、0.2 g/L MgSO4·7H2O、0.1 g/L NaCl、 0.2 g/L CaSO4、4 mL/L Rh 微量元素液（5 g/L H3BO3，5 g/L NaMnO4），余量為水，pH值 6.8～7.0。YMA斜面培養基：YMA液體培養基加入1.8%瓊脂。

1.1.3主要儀器和設備1102C型恒溫振蕩培養箱（上海知楚儀器有限公司），SW-CJ-1G型超凈工作臺（蘇州凈化有限公司），LRH-150型生化培養箱（上海一恒科學儀器公司），LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器廠），Labnet P3960移液槍（美國萊伯特公司），YP-B10002型電子天平（上海光正醫療儀器有限公司），PHS-25型pH計（上海盛磁儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1種子液培養斜面菌種28 ℃活化24 h后，取2環接入裝有200 mL YMA液體培養基的500 mL三角瓶中，28 ℃振蕩培養48 h后，按照5%接種量接入單因素試驗及 Box-Behnken 試驗培養基中。

1.2.2活菌數測定方法采用平板菌落計數法測定活菌數。

1.2.3單因素分析法

1.2.3.1碳源濃度對活菌數的影響陳海榮等研究發現，紫云英根瘤菌在甘露醇、蔗糖中生長較好[8]，但因甘露醇生產成本較高，所以選定蔗糖作為碳源。試驗條件為0.9%酵母膏、0.05% K2HPO4、0.02% MgSO4·7H2O、0.01% NaCl、002% CaSO4、4 mL/L Rh 微量元素液，初始pH值 7.0，蔗糖濃度分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%，28 ℃搖瓶培養48 h，測定活菌數以確定最佳蔗糖濃度。

1.2.3.2氮源濃度對活菌數的影響確定最佳蔗糖濃度后，將酵母膏濃度分別設為0.1%、0.5%、0.9%、1.3%、1.7%，培養基其他組分不變，初始pH值 7.0，28 ℃搖瓶培養48 h，測定活菌數以確定最佳酵母膏濃度。

1.2.3.3初始pH值對活菌數的影響將碳源、氮源設定為上述試驗確定的最佳濃度，培養基其他組分不變，將初始pH值分別設為 6.5、7、7.5、8、8.5，28 ℃搖瓶培養48 h，測定活菌數以確定最佳初始pH值。

1.2.4響應面法優化紫云英根瘤菌發酵條件根據 Box-Behnken 試驗設計原理，將單因素試驗確定的最佳蔗糖濃度、酵母膏濃度、初始pH值作為自變量，以活菌數為響應值，設計3因素3水平的響應面分析試驗，進一步對紫云英根瘤菌發酵條件進行優化。

2結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1最佳蔗糖濃度的確定由圖1可知，當蔗糖濃度較低時，紫云英根瘤菌活菌數隨著蔗糖濃度的增大而增加；當蔗糖濃度為2%時，活菌數達到最大值；之后，紫云英根瘤菌活菌數略有下降。因此確定最佳蔗糖濃度為2%。

2.1.2最佳酵母膏濃度的確定由圖2可知，在一定范圍內，紫云英活菌數隨著酵母膏濃度增大而增加，當酵母膏濃度為0.9%、1.3%時活菌數較高，但兩者差異較小，考慮到生產成本問題，所以確定最佳酵母膏濃度為0.9%。

2.1.3最佳初始pH值的確定微生物在生長過程中機體內的絕大多數反應是酶促反應，而酶促反應需要一個最適初始pH值范圍，在該范圍內只要條件適合，酶促反應速率最高，微生物生長速率最大[9]。由圖3可知，隨著初始pH值增加，紫云英根瘤菌活菌數呈先升高后降低的趨勢，當pH值為70時，活菌數最大，所以確定最佳初始pH值為7.0。

2.2響應面法優化紫云英根瘤菌發酵條件

2.2.1Box-Behnken 試驗設計根據單因素試驗結果，確定中心點為蔗糖濃度2%、酵母膏濃度0.9%、pH值7.0。表1是響應面法優化紫云英根瘤菌發酵條件試驗的因素及水平，表2是試驗設計和結果。采用Design-Expert 8軟件對試驗結果進行二次回歸方程預測及方差分析，結果見表3。

3結論與討論

許多學者開展了關于根瘤菌培養基優化的研究[10]，但主要集中在大豆、花生等經濟作物上，而有關紫云英根瘤菌發酵的研究鮮有報道。紫云英根瘤菌的常用培養基是YMA培養基，由于YMA培養基是半合成培養基，在被用于大規模發酵生產時成本較高[11]。本研究從降低發酵成本角度，以蔗糖、

酵母膏為主要原料優化紫云英根瘤菌發酵培養基。微生物生長受多種外界因素的影響，如營養條件、pH值等，其中碳源、氮源是微生物生長需要最多的營養成分。在微生物發酵生產時，提供適量碳源、氮源，既能達到生長量，又不造成資源浪費。pH值是影響微生物生長的主要因素之一，發酵生產時，對初始pH值的控制尤為重要。本研究通過單因素試驗確定碳源（蔗糖）濃度、氮源（酵母膏）濃度、初始pH值后，進一步采用響應曲面設計法進行優化。

響應曲面設計法是一種尋找多因子系統中最佳條件的數學統計方法，通過對函數響應面和等高線的分析，能夠精確研究各因子之間的關系，從而獲得最優工藝參數[12]。本研究借助Design Expert 8軟件進行響應面試驗的設計和數據分析，在紫云英根瘤菌發酵培養基優化過程中取得良好的效果，并獲得二次回歸模型，得到最佳培養基為：蔗糖濃度2.19%，酵母膏濃度0.9%，初始pH值 6.89，該條件下根瘤菌活菌數為20.533億CFU/mL。通過3次平行試驗驗證表明，該模型合理可靠，能夠較好地預測紫云英根瘤菌實際發酵情況，為紫云英根瘤菌工業化發酵生產提供了技術支持。

參考文獻：

[1]陳堅，張輝，朱炳耀，等. 紫云英SSR分子標記的開發及在品種鑒別中的應用[J]. 作物學報，2011，37（9）：1592-1596.

[2]沈生元，莫美英，趙洪祥，等. 氮磷肥單施和配施對紫云英產量及耕地質量的影響[J]. 江蘇農業科學，2010（5）：131-132.

[3]王華，黃宇，陽柏蘇，等. 中亞熱帶紅壤地區稻-稻-草輪作系統稻田土壤質量評價[J]. 生態學報，2005，25（12）：3271-3281.

[4]林新堅，曹衛東，吳一群，等. 紫云英研究進展[J]. 草業科學，2011，28（1）：135-140.

[5]陳海榮，郭照輝，魏小武，等. 根瘤菌肥對紫云英生長的影響研究[J]. 現代農業科技，2012（10）：260-261，264.

[6]李青盛. 紫云英接種根瘤菌劑的效果[J]. 農技服務，2010，27（7）：856.

[7]劉英，郭熙盛，王允青，等. 紫云英根瘤菌應用效果研究[J]. 安徽農業科學，2012，40（24）：12046-12047.

[8]陳海榮，郭照輝，劉前剛，等. 紫云英根瘤菌培養基的選擇與優化[J]. 湖南農業科學，2011（1）：13-15.

[9]曾曉希，周洪波，柳建設，等. 脫硅細菌B.mucilaginosus Lv1-2的培養條件研究[J]. 現代生物醫學進展，2006，6（9）：5-7.

[10]遲玉成，Fan T Q，樊堂群，等. 慢生型花生根瘤菌培養基優化研究[J]. 花生學報，2007，36（4）：25-28.

[11]劉保平，周俊初. 根瘤菌菌劑研究[J]. 湖北農業科學，2006，45（1）：57-61.

[12]Vadde K K，Syrotiuk V R，Montgomery D C. Optimizing protocol interaction using response surface methodology[J]. IEEE Transations on Mobile Computing，2006，5（6）：627-639.

2.1.3最佳初始pH值的確定微生物在生長過程中機體內的絕大多數反應是酶促反應，而酶促反應需要一個最適初始pH值范圍，在該范圍內只要條件適合，酶促反應速率最高，微生物生長速率最大[9]。由圖3可知，隨著初始pH值增加，紫云英根瘤菌活菌數呈先升高后降低的趨勢，當pH值為70時，活菌數最大，所以確定最佳初始pH值為7.0。

2.2響應面法優化紫云英根瘤菌發酵條件

2.2.1Box-Behnken 試驗設計根據單因素試驗結果，確定中心點為蔗糖濃度2%、酵母膏濃度0.9%、pH值7.0。表1是響應面法優化紫云英根瘤菌發酵條件試驗的因素及水平，表2是試驗設計和結果。采用Design-Expert 8軟件對試驗結果進行二次回歸方程預測及方差分析，結果見表3。

3結論與討論

許多學者開展了關于根瘤菌培養基優化的研究[10]，但主要集中在大豆、花生等經濟作物上，而有關紫云英根瘤菌發酵的研究鮮有報道。紫云英根瘤菌的常用培養基是YMA培養基，由于YMA培養基是半合成培養基，在被用于大規模發酵生產時成本較高[11]。本研究從降低發酵成本角度，以蔗糖、

酵母膏為主要原料優化紫云英根瘤菌發酵培養基。微生物生長受多種外界因素的影響，如營養條件、pH值等，其中碳源、氮源是微生物生長需要最多的營養成分。在微生物發酵生產時，提供適量碳源、氮源，既能達到生長量，又不造成資源浪費。pH值是影響微生物生長的主要因素之一，發酵生產時，對初始pH值的控制尤為重要。本研究通過單因素試驗確定碳源（蔗糖）濃度、氮源（酵母膏）濃度、初始pH值后，進一步采用響應曲面設計法進行優化。

響應曲面設計法是一種尋找多因子系統中最佳條件的數學統計方法，通過對函數響應面和等高線的分析，能夠精確研究各因子之間的關系，從而獲得最優工藝參數[12]。本研究借助Design Expert 8軟件進行響應面試驗的設計和數據分析，在紫云英根瘤菌發酵培養基優化過程中取得良好的效果，并獲得二次回歸模型，得到最佳培養基為：蔗糖濃度2.19%，酵母膏濃度0.9%，初始pH值 6.89，該條件下根瘤菌活菌數為20.533億CFU/mL。通過3次平行試驗驗證表明，該模型合理可靠，能夠較好地預測紫云英根瘤菌實際發酵情況，為紫云英根瘤菌工業化發酵生產提供了技術支持。

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2.1.3最佳初始pH值的確定微生物在生長過程中機體內的絕大多數反應是酶促反應，而酶促反應需要一個最適初始pH值范圍，在該范圍內只要條件適合，酶促反應速率最高，微生物生長速率最大[9]。由圖3可知，隨著初始pH值增加，紫云英根瘤菌活菌數呈先升高后降低的趨勢，當pH值為70時，活菌數最大，所以確定最佳初始pH值為7.0。

2.2響應面法優化紫云英根瘤菌發酵條件

2.2.1Box-Behnken 試驗設計根據單因素試驗結果，確定中心點為蔗糖濃度2%、酵母膏濃度0.9%、pH值7.0。表1是響應面法優化紫云英根瘤菌發酵條件試驗的因素及水平，表2是試驗設計和結果。采用Design-Expert 8軟件對試驗結果進行二次回歸方程預測及方差分析，結果見表3。

3結論與討論

許多學者開展了關于根瘤菌培養基優化的研究[10]，但主要集中在大豆、花生等經濟作物上，而有關紫云英根瘤菌發酵的研究鮮有報道。紫云英根瘤菌的常用培養基是YMA培養基，由于YMA培養基是半合成培養基，在被用于大規模發酵生產時成本較高[11]。本研究從降低發酵成本角度，以蔗糖、

酵母膏為主要原料優化紫云英根瘤菌發酵培養基。微生物生長受多種外界因素的影響，如營養條件、pH值等，其中碳源、氮源是微生物生長需要最多的營養成分。在微生物發酵生產時，提供適量碳源、氮源，既能達到生長量，又不造成資源浪費。pH值是影響微生物生長的主要因素之一，發酵生產時，對初始pH值的控制尤為重要。本研究通過單因素試驗確定碳源（蔗糖）濃度、氮源（酵母膏）濃度、初始pH值后，進一步采用響應曲面設計法進行優化。

響應曲面設計法是一種尋找多因子系統中最佳條件的數學統計方法，通過對函數響應面和等高線的分析，能夠精確研究各因子之間的關系，從而獲得最優工藝參數[12]。本研究借助Design Expert 8軟件進行響應面試驗的設計和數據分析，在紫云英根瘤菌發酵培養基優化過程中取得良好的效果，并獲得二次回歸模型，得到最佳培養基為：蔗糖濃度2.19%，酵母膏濃度0.9%，初始pH值 6.89，該條件下根瘤菌活菌數為20.533億CFU/mL。通過3次平行試驗驗證表明，該模型合理可靠，能夠較好地預測紫云英根瘤菌實際發酵情況，為紫云英根瘤菌工業化發酵生產提供了技術支持。

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[8]陳海榮，郭照輝，劉前剛，等. 紫云英根瘤菌培養基的選擇與優化[J]. 湖南農業科學，2011（1）：13-15.

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