紅芽大戟組織培養條件的優化

李林軒等

摘要：優化紅芽大戟組織培養快速繁殖技術，為保護紅芽大戟的野生資源提供技術支撐。分別以MS和1/2MS為基本培養基，采用正交設計對影響紅芽大戟組織培養的繼代增殖和誘導生根進行了優化。結果表明，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+0.2 mg/L NAA+0.3 g/L 活性炭有利于叢生芽繼代增殖；1/2MS+0.75 mg/L IBA+0.2 mg/L PP333適于誘導生根獲得再生植株；生根苗移栽于泥炭+珍珠巖（體積比1 ∶1）的混合基質上，成活率達92%。

關鍵詞：紅芽大戟；組織培養；繼代增殖；正交設計

中圖分類號： Q943.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0060-03

收稿日期：2013-08-13

基金項目：廣西科學研究與技術開發計劃（編號：桂科重1355001-5-12）；廣西南寧市科學技術開發計劃（編號：201002049C）。

作者簡介：李林軒（1986—），男，廣西桂林人，助理研究員，從事中藥資源保護與開發利用研究。E-mail：starry1125@sina.com。

通信作者：韋坤華，博士，助理研究員，從事藥用植物生物技術研究。E-mail：divinekh@163.com。紅大戟（Knoxia valerianoides Thorel et Pitard）為茜草科多年生草本植物紅芽大戟的干燥塊莖。主產于廣西、廣東，云南、福建、海南亦有少量分布，生長在低山坡草叢中的半陰、半陽處。紅大戟苦、寒、有小毒，歸肺、脾、腎經，藥用功能為瀉水逐飲，攻毒消腫散結，主治胸腹積水、兩便不利、癰腫瘡毒、瘰疬痰核[1]，還具有抗菌作用，為中成藥紫金錠的主藥[2]。由于紅大戟使用量的增加、藥材使用與種植模式的改變，紅芽大戟長期處于野生狀態，人為亂采濫挖，紅芽大戟野生資源急劇減少，在某些區域幾乎已經絕跡。紅芽大戟自然繁殖主要通過種子，但由于種胚發育不良，自然散落種子發芽率不到1%。采用常規方法貯藏1年以上的種子，基本喪失活力，幾乎不能出苗[3-4]，很難滿足市場需求。為更好開發利用紅芽大戟資源，擴大藥源，本試驗通過正交試驗優化紅芽大戟組織培養條件，為紅芽大戟快速繁殖工廠化生產育苗提供技術支撐。

1材料與方法

1.1無菌材料

材料采集自廣西藥用植物園科研基地內引種栽培生長健壯的、無病蟲害的植株，剪取嫩芽作為試驗材料。將嫩芽置洗潔精水中浸泡10 min，用自來水流水沖洗15 min，在超凈工作臺上置于0.1%HgCl2溶液浸泡消毒8 min，再用無菌水浸洗4次，每次浸洗5 min，然后將帶有嫩芽的外植體接種于添加 6-芐基腺嘌呤（6-BA）2.0 mg/L+萘乙酸（NAA）0.4 mg/L的MS培養基上[5]。在室內自然散射光照下培養獲得無菌叢生芽。

1.2叢生芽快繁培養基優化

將紅芽大戟試管苗在MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L 培養基中繼代5次后，產生的叢生芽出現枯葉、玻璃化等現象。在對繁殖培養基進行初步篩選的基礎上，在 MS+0.3 g/L 活性炭為培養基的基礎上以6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L）、NAA （0.1、0.2、0.4 mg/L）、IAA（0.1、0.2、0.4 mg/L）3種激素的3個水平進行正交試驗，對紅芽大戟的繁殖培養基進行優化，每個處理10瓶，每瓶3個單芽，30 d后以測試管苗生長情況和芽增殖倍數[芽增殖倍數=（30 d后芽數-接種時芽數）/接種時芽數]為主要考察指標來優化繁殖培養基。

1.3生根培養基篩選

為了篩選最佳的生根培養基，在1/2MS為培養基的基礎上以IBA（0.5、0.75、1.0 mg/L）、PP333（0.1、0.2、0.4 mg/L）和活性炭（0、0.5、1.0 g/L）3種因素的3個水平進行正交試驗，對紅芽大戟的生根培養基進行優化，每個處理10瓶，每瓶20個單芽，30 d后統計生根率及平均生根數：生根率=生根芽數/接種總數×100%；平均生根數=總生根數/接種總數×100%。

2結果與分析

2.1叢生芽快繁培養基優化

2.2叢生芽誘導生根

將生長健壯的芽苗單切接入紅芽大戟生根培養基中，30 d 后統計生根率及平均生根數。為了篩選最佳生根培養基，使用IBA、PP333和活性炭3個水平設計正交試驗，結果（表3、表4）表明，IBA的濃度對試管苗的生根率有顯著的影響，但PP333和活性炭對紅芽大戟生根率影響不大。對平均生根數分析表明，IBA和PP333對試管苗的平均生根數均有顯著影響，PP333影響要大于IBA，而活性炭影響不顯著（表3、表5）。進一步分析，生根率和平均生根數主要受IBA濃度的影響，在0.5～0.75 mg/L濃度范圍內，隨著IBA濃度的增大生根率和平均生根數上升，當IBA濃度高于0.75mg/L時，生根率和平均生根數都下降，表明IBA濃度過高不利紅芽大戟叢生芽生根。添加低濃度的多效唑有利于叢生芽生長控制和生根，當IBA濃度不變、PP333濃度為0.1～0.2 mg/L時，生根率和平均生根數隨著濃度的增大而升高，當濃度升高至0.4 mg/L時，生根率和平均生根數有所下降，高濃度的PP333抑制叢生芽的生根，最佳的生根培養基為1/2MS+0.75 mg/L IBA+0.2 mg/L PP333，在此培養基上的生根率達到100%，平均生根數為6.7條（圖2）。

2.3再生苗的移栽

根據紅芽大戟的生長特性，將已生根的試管苗開蓋煉苗2～3 d，洗凈根部培養基，移栽于消過毒的泥炭+珍珠巖（體積比 1 ∶1）的混合基質上，置于透光度為75%育苗棚中，每天噴灑少量的水，30 d后移栽成活率達92%。表4紅芽大戟生根培養基生根率方差分析

方差來源離均差平方和自由度方差F值P值備注IBA542.892271.4456.810.01≤P<0.05顯著PP333157.56278.7816.490.05≤P<0.1不顯著活性炭2.8921.440.30P≥0.1不顯著誤差9.5624.78注同表2。

3討論

培養基中激素的種類與濃度對植物的繁殖與生根非常關鍵[7-9]。6-BA是重要的植物激素，可以促進細胞分裂、側芽生長等[10]。 IAA是植物自身能夠形成的內源生長素，能促進細胞分裂與細胞生長，在植物的生長與發育上起著關鍵作用，通過調節或影響植物整體或細胞水平的多種反應發揮作用[11]。NAA是廣譜型植物生長調節劑，具有促進細胞分裂與擴大、誘導形成不定根等作用，但是在組織培養過程中也容易致使材料老化和形成愈傷組織。本研究中我們使用 6-BA、NAA和IAA進行繁殖篩選，IBA、PP333和活性炭進行生根篩選，結果發現如果細胞分裂素的濃度超過 2.0 mg/L，芽的增殖會出現異常，如玻璃化、老化等；如NAA濃度高于 0.2 mg/L 時，愈傷較多，影響增殖倍數。最終確定最佳的增殖培養基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+0.2 mg/L NAA+0.3 g/L，與凌征柱等研究使用的誘導培養基MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L[12]和MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L[13]稍有不同，外源激素總濃度相對較低，這有利于降低材料繼代變異可能性。

IBA是植物自身能夠形成的內源生長素，是植物主根生長促進劑，能提高發芽率、成活率，并能促進細胞分裂與細胞生長，誘導形成不定根。在植物組織培養過程中，內源激素形成速度緩慢，無法滿足植物生長的需求，需要從培養基中吸收。相關研究指出，PP333能促進植物的根系生長和次生根的發生。本試驗中選苗是生根的關鍵因素，主要標準是苗的健壯程度，細弱苗生根移栽后很難成活。紅芽大戟生根時選擇健壯組培苗進行生根培養，同時加入低濃度PP333促進次生根的發生，同時不易讓生根苗生長過高，試管苗纖細、過高移栽后都不易成活。在生根過程中IBA和PP333有協同促進效果，0.75 mg/L 的IBA與0.2 mg/L PP333聯合使用生根效果最為理想，紅芽大戟苗莖稈粗壯、根數多、根系發育良好，移栽后成活率較高。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京：化學工業出版社，2009：140-141.

[2]廣東中藥志編委會. 廣東中藥志：第1卷[M]. 廣州：廣東科學技術出版社，1994：220-222.

[3]何茂金，胡廷松，黃健君，等. 紅大戟的生態環境及生物學特性的觀察[J]. 中國野生植物資源，1994（2）：12-14.

[4]陳芳清，徐祥浩. 藥用植物紅芽大戟的個體生態學研究[J]. 武漢植物學研究，1995，13（2）：147-151.

[5]衛錫錦. 紅大戟的栽培技術[J]. 中藥材，1997，20（12）：598.

[6]韋瑩，余麗瑩，黃浩，等. 紅芽大戟愈傷組織誘導及分化研究[J]. 廣西植物，2009，29（6）：817-821.

[7]韋榮昌，李林軒，吳慶華，等. 植物激素對涼粉草扦插生根的影響[J]. 江蘇農業科學，2013，41（8）：239-240.

[8]王菲彬，王斐，管玲玲，等，植物激素對東方百合試管苗鱗片分化不定芽的影響[J]. 江蘇農業科學，2013，41（6）：53-55.

[9]陳豫，胡偉，何磊. 不同濃度激素對胡蘿愈傷組織誘導的影響[J]. 江蘇農業科學，2013，41（2）：54-56.

[10]Polanco M C，Peláez M I，Ruiz M L. Factors affecting callus and shoot formation from in vitro cultures of Lens culinaris Medik[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1988，15（2）：175-182.

[11]Hagen G，Guilfoyle T. Auxin-responsive gene expression：genes，promoters and regulatory factors[J]. Plant Molecular Biology，2002，49（3/4）：373-385.

[12]凌征柱，覃文流，余麗瑩，等. 紅大戟的組織培養及植株再生[J]. 中草藥，2005，36（10）：1555-1557.

[13]黃浩. 藥用植物紅芽大戟組織培養的研究[D]. 南寧：廣西大學，2006.

方差來源離均差平方和自由度方差F值P值備注IBA542.892271.4456.810.01≤P<0.05顯著PP333157.56278.7816.490.05≤P<0.1不顯著活性炭2.8921.440.30P≥0.1不顯著誤差9.5624.78注同表2。

3討論

培養基中激素的種類與濃度對植物的繁殖與生根非常關鍵[7-9]。6-BA是重要的植物激素，可以促進細胞分裂、側芽生長等[10]。 IAA是植物自身能夠形成的內源生長素，能促進細胞分裂與細胞生長，在植物的生長與發育上起著關鍵作用，通過調節或影響植物整體或細胞水平的多種反應發揮作用[11]。NAA是廣譜型植物生長調節劑，具有促進細胞分裂與擴大、誘導形成不定根等作用，但是在組織培養過程中也容易致使材料老化和形成愈傷組織。本研究中我們使用 6-BA、NAA和IAA進行繁殖篩選，IBA、PP333和活性炭進行生根篩選，結果發現如果細胞分裂素的濃度超過 2.0 mg/L，芽的增殖會出現異常，如玻璃化、老化等；如NAA濃度高于 0.2 mg/L 時，愈傷較多，影響增殖倍數。最終確定最佳的增殖培養基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+0.2 mg/L NAA+0.3 g/L，與凌征柱等研究使用的誘導培養基MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L[12]和MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L[13]稍有不同，外源激素總濃度相對較低，這有利于降低材料繼代變異可能性。

IBA是植物自身能夠形成的內源生長素，是植物主根生長促進劑，能提高發芽率、成活率，并能促進細胞分裂與細胞生長，誘導形成不定根。在植物組織培養過程中，內源激素形成速度緩慢，無法滿足植物生長的需求，需要從培養基中吸收。相關研究指出，PP333能促進植物的根系生長和次生根的發生。本試驗中選苗是生根的關鍵因素，主要標準是苗的健壯程度，細弱苗生根移栽后很難成活。紅芽大戟生根時選擇健壯組培苗進行生根培養，同時加入低濃度PP333促進次生根的發生，同時不易讓生根苗生長過高，試管苗纖細、過高移栽后都不易成活。在生根過程中IBA和PP333有協同促進效果，0.75 mg/L 的IBA與0.2 mg/L PP333聯合使用生根效果最為理想，紅芽大戟苗莖稈粗壯、根數多、根系發育良好，移栽后成活率較高。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京：化學工業出版社，2009：140-141.

[2]廣東中藥志編委會. 廣東中藥志：第1卷[M]. 廣州：廣東科學技術出版社，1994：220-222.

[3]何茂金，胡廷松，黃健君，等. 紅大戟的生態環境及生物學特性的觀察[J]. 中國野生植物資源，1994（2）：12-14.

[4]陳芳清，徐祥浩. 藥用植物紅芽大戟的個體生態學研究[J]. 武漢植物學研究，1995，13（2）：147-151.

[5]衛錫錦. 紅大戟的栽培技術[J]. 中藥材，1997，20（12）：598.

[6]韋瑩，余麗瑩，黃浩，等. 紅芽大戟愈傷組織誘導及分化研究[J]. 廣西植物，2009，29（6）：817-821.

[7]韋榮昌，李林軒，吳慶華，等. 植物激素對涼粉草扦插生根的影響[J]. 江蘇農業科學，2013，41（8）：239-240.

[8]王菲彬，王斐，管玲玲，等，植物激素對東方百合試管苗鱗片分化不定芽的影響[J]. 江蘇農業科學，2013，41（6）：53-55.

[9]陳豫，胡偉，何磊. 不同濃度激素對胡蘿愈傷組織誘導的影響[J]. 江蘇農業科學，2013，41（2）：54-56.

[10]Polanco M C，Peláez M I，Ruiz M L. Factors affecting callus and shoot formation from in vitro cultures of Lens culinaris Medik[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1988，15（2）：175-182.

[11]Hagen G，Guilfoyle T. Auxin-responsive gene expression：genes，promoters and regulatory factors[J]. Plant Molecular Biology，2002，49（3/4）：373-385.

[12]凌征柱，覃文流，余麗瑩，等. 紅大戟的組織培養及植株再生[J]. 中草藥，2005，36（10）：1555-1557.

[13]黃浩. 藥用植物紅芽大戟組織培養的研究[D]. 南寧：廣西大學，2006.

方差來源離均差平方和自由度方差F值P值備注IBA542.892271.4456.810.01≤P<0.05顯著PP333157.56278.7816.490.05≤P<0.1不顯著活性炭2.8921.440.30P≥0.1不顯著誤差9.5624.78注同表2。

3討論

培養基中激素的種類與濃度對植物的繁殖與生根非常關鍵[7-9]。6-BA是重要的植物激素，可以促進細胞分裂、側芽生長等[10]。 IAA是植物自身能夠形成的內源生長素，能促進細胞分裂與細胞生長，在植物的生長與發育上起著關鍵作用，通過調節或影響植物整體或細胞水平的多種反應發揮作用[11]。NAA是廣譜型植物生長調節劑，具有促進細胞分裂與擴大、誘導形成不定根等作用，但是在組織培養過程中也容易致使材料老化和形成愈傷組織。本研究中我們使用 6-BA、NAA和IAA進行繁殖篩選，IBA、PP333和活性炭進行生根篩選，結果發現如果細胞分裂素的濃度超過 2.0 mg/L，芽的增殖會出現異常，如玻璃化、老化等；如NAA濃度高于 0.2 mg/L 時，愈傷較多，影響增殖倍數。最終確定最佳的增殖培養基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+0.2 mg/L NAA+0.3 g/L，與凌征柱等研究使用的誘導培養基MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L[12]和MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L[13]稍有不同，外源激素總濃度相對較低，這有利于降低材料繼代變異可能性。

IBA是植物自身能夠形成的內源生長素，是植物主根生長促進劑，能提高發芽率、成活率，并能促進細胞分裂與細胞生長，誘導形成不定根。在植物組織培養過程中，內源激素形成速度緩慢，無法滿足植物生長的需求，需要從培養基中吸收。相關研究指出，PP333能促進植物的根系生長和次生根的發生。本試驗中選苗是生根的關鍵因素，主要標準是苗的健壯程度，細弱苗生根移栽后很難成活。紅芽大戟生根時選擇健壯組培苗進行生根培養，同時加入低濃度PP333促進次生根的發生，同時不易讓生根苗生長過高，試管苗纖細、過高移栽后都不易成活。在生根過程中IBA和PP333有協同促進效果，0.75 mg/L 的IBA與0.2 mg/L PP333聯合使用生根效果最為理想，紅芽大戟苗莖稈粗壯、根數多、根系發育良好，移栽后成活率較高。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京：化學工業出版社，2009：140-141.

[2]廣東中藥志編委會. 廣東中藥志：第1卷[M]. 廣州：廣東科學技術出版社，1994：220-222.

[3]何茂金，胡廷松，黃健君，等. 紅大戟的生態環境及生物學特性的觀察[J]. 中國野生植物資源，1994（2）：12-14.

[4]陳芳清，徐祥浩. 藥用植物紅芽大戟的個體生態學研究[J]. 武漢植物學研究，1995，13（2）：147-151.

[5]衛錫錦. 紅大戟的栽培技術[J]. 中藥材，1997，20（12）：598.

[6]韋瑩，余麗瑩，黃浩，等. 紅芽大戟愈傷組織誘導及分化研究[J]. 廣西植物，2009，29（6）：817-821.

[7]韋榮昌，李林軒，吳慶華，等. 植物激素對涼粉草扦插生根的影響[J]. 江蘇農業科學，2013，41（8）：239-240.

[8]王菲彬，王斐，管玲玲，等，植物激素對東方百合試管苗鱗片分化不定芽的影響[J]. 江蘇農業科學，2013，41（6）：53-55.

[9]陳豫，胡偉，何磊. 不同濃度激素對胡蘿愈傷組織誘導的影響[J]. 江蘇農業科學，2013，41（2）：54-56.

[10]Polanco M C，Peláez M I，Ruiz M L. Factors affecting callus and shoot formation from in vitro cultures of Lens culinaris Medik[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1988，15（2）：175-182.

[11]Hagen G，Guilfoyle T. Auxin-responsive gene expression：genes，promoters and regulatory factors[J]. Plant Molecular Biology，2002，49（3/4）：373-385.

[12]凌征柱，覃文流，余麗瑩，等. 紅大戟的組織培養及植株再生[J]. 中草藥，2005，36（10）：1555-1557.

[13]黃浩. 藥用植物紅芽大戟組織培養的研究[D]. 南寧：廣西大學，2006.