褐飛虱唾液分泌物中細(xì)菌多樣性的初步分析

唐明等

摘要：褐飛虱是我國(guó)水稻生產(chǎn)中的重要害蟲，其唾液在取食過程中起著重要的作用。在筆者的前期研究中發(fā)現(xiàn)，褐飛虱在取食時(shí)會(huì)分泌凝膠狀唾液和水溶性唾液。筆者收集了褐飛虱的水溶性唾液分泌物，通過建立16S ribosomal DNA（rDNA）文庫檢測(cè)了唾液分泌物中的微生物組成，共發(fā)現(xiàn)6種細(xì)菌，它們都屬于變形菌門，其中屬于γ變形菌亞門、β變形菌亞門的分別有4種、2種。此外研究還對(duì)褐飛虱取食后殘留在水稻葉鞘中的口針鞘內(nèi)部進(jìn)行了透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在口針鞘內(nèi)部和周圍都有微生物的存在。研究結(jié)果可為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)褐飛虱的取食行為以及褐飛虱體內(nèi)的細(xì)菌型共生菌的生物學(xué)特性提供參考和依據(jù)。

關(guān)鍵詞：褐飛虱；唾液分泌物；細(xì)菌多樣性；細(xì)菌型共生菌

中圖分類號(hào)： S435.112+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）04-0090-03

收稿日期：2013-08-17

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31201514）；貴州省科技基金（編號(hào)：黔科合J字[2012]2277號(hào)）；貴州省高層次人才科研條件特助經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（編號(hào)：TZJF-2011年-39號(hào)）；貴陽市社會(huì)發(fā)展與民生科技項(xiàng)目（編號(hào)：筑科合同[2012103]85號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：唐明（1979—），男，貴州遵義人，博士，講師，主要從事植物保護(hù)研究。Tel：（0851）6702541；E-mail：tangming2006@hotmail.com。

通信作者：乙引，男，重慶合川人，博士，教授，主要植物生理生化研究。Tel：（0851）6702541；E-mail：yiyin@gznu.edu.cn。褐飛虱又名稻褐虱[Nilaparvata lugens（Stl）]，屬同翅目（Homoptera）蟬亞目（Cicademorpha）飛虱科（Delphacidae）。褐飛虱是典型的刺吸式口器昆蟲，通過口針取食水稻韌皮部維管束中的汁液，因此褐飛虱是水稻生產(chǎn)中的重要害蟲，具有季節(jié)性、遷飛性、暴發(fā)性和猖獗性等特點(diǎn)，給我國(guó)水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失[1]。研究表明，褐飛虱取食過程包括口針穿刺和吸取汁液2個(gè)階段，其中穿刺過程在維管束外面的薄壁組織處進(jìn)行，口針刺入維管束后，褐飛虱分泌膠狀唾液并凝結(jié)形成口針鞘，由于口針每次刺入的方向不同，導(dǎo)致形成分叉狀的口針鞘；當(dāng)口針刺入維管束組織后，褐飛虱即停止口針穿刺和分泌膠狀唾液，通過口針鞘吸取汁液，這一階段褐飛虱分泌水溶性唾液，水溶性唾液具有很復(fù)雜的生物學(xué)功能，包括分泌降解植物細(xì)胞壁的酶、防止植物形成胼胝質(zhì)而阻塞維管束等[2-4]。

研究者對(duì)口針鞘的形態(tài)學(xué)進(jìn)行了詳細(xì)的研究，觀察到褐飛虱在分泌水溶性唾液的過程中，微生物通過褐飛虱口針鞘向水稻葉鞘內(nèi)部進(jìn)行傳播[4]。研究者推測(cè)，褐飛虱在對(duì)水稻取食的過程中，其體內(nèi)的微生物可能參與了取食過程并同時(shí)感染了水稻。昆蟲體內(nèi)的共生菌在昆蟲的生長(zhǎng)、生殖以及植物病害的傳播等方面具有特殊的作用，是探討生命起源與進(jìn)化關(guān)系的理想模型[5]。褐飛虱體內(nèi)的真菌型的類酵母共生菌（yeast-like symbiote，YLS）對(duì)褐飛虱宿主有著重要的生理功能[6]，褐飛虱若缺乏類酵母類共生菌，其若蟲時(shí)期則明顯延長(zhǎng)，若蟲成活率，雌成蟲體重、生長(zhǎng)速率、產(chǎn)卵量明顯低于正常褐飛虱[7]。還有研究表明，褐飛虱田間種群的致害性與YLS的數(shù)量有關(guān)，水稻抗性品種對(duì)YLS的作用與褐飛虱種群對(duì)抗性品種的適應(yīng)性有關(guān)[8]。此外研究還發(fā)現(xiàn)，褐飛虱體內(nèi)也存在細(xì)菌型共生菌，研究者通過建立并分析褐飛虱細(xì)菌型共生菌的16S ribosomal DNA（rDNA）文庫發(fā)現(xiàn)，3個(gè)生物型的褐飛虱（生物型1、2、3）體內(nèi)有18種細(xì)菌型共生菌，這些共生菌在分類上屬于4個(gè)門（Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria、Bacteroidetes），并且這18種共生菌的種類與生物型有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系[9]。此外還有一些研究也報(bào)道了褐飛虱體內(nèi)的細(xì)菌型共生菌[10-11]。但是關(guān)于褐飛虱細(xì)菌型共生菌的生物學(xué)功能，以及細(xì)菌型共生菌與褐飛虱取食過程分泌的細(xì)菌微生物之間的關(guān)系等問題還有待研究。

為了研究褐飛虱在取食過程中分泌了哪些微生物進(jìn)入水稻，本試驗(yàn)使用透射電子顯微鏡觀察褐飛虱取食后遺留在水稻葉鞘中的口針鞘；收集并濃縮了褐飛虱的唾液分泌物，以研究其中的細(xì)菌型微生物組成。研究將為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)褐飛虱的取食行為及褐飛虱細(xì)菌型共生菌的生物學(xué)特性提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

生物型1的褐飛虱于2007年采種于位于杭州市的中國(guó)水稻研究所，在武漢大學(xué)遺傳研究所養(yǎng)蟲室的Taichung Native 1（TN1）水稻上進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖，飼養(yǎng)條件為：平均溫度 28 ℃，平均光照16 h/d。

將TN1水稻種子用0.15%氯化汞消毒20 min，用無菌水洗6次，每次1 min；然后在無菌濾紙上濾干后用1/2 MS培養(yǎng)基在試管中進(jìn)行無菌苗的培養(yǎng)，每個(gè)試管接種1粒；待植株長(zhǎng)到約3葉期（高10～15 cm）時(shí)，使用褐飛虱生物型1進(jìn)行取食，每株無菌苗平均接約20頭的4～5齡若蟲，取食時(shí)間 24 h；去掉植株上面的褐飛虱若蟲，將植株從培養(yǎng)基中拔出，去掉葉和根部，留下葉鞘組織作為透射電鏡觀察的樣品，以未放蟲取食的水稻葉鞘作為對(duì)照材料。

1.2褐飛虱唾液分泌物的收集

用2層拉伸的Parafilm（BEMIS）封住2側(cè)開口的圓柱形塑料容器（直徑約8 cm）的一側(cè)，在2層膜中間的夾層中加入約5 mL預(yù)先用0.22 μm濾膜過濾的2.5%蔗糖溶液，在瓶?jī)?nèi)放入約200頭饑餓的褐飛虱，容器的另一側(cè)用紗網(wǎng)罩住，防止褐飛虱窒息和逃逸。然后將容器倒放，使褐飛虱停留在內(nèi)側(cè)的Parafilm膜上取食蔗糖溶液（取食過程中分泌水溶性唾液）。48h后用注射器收集蔗糖溶液，于-20 ℃保存。試驗(yàn)重復(fù)數(shù)次，收集的蔗糖溶液用MAXI Dry Lyo凍干機(jī)（Heto-Holten）濃縮，通過升華作用使混合物脫水。將濃縮物于 -20 ℃ 保存。

1.3唾液分泌物中細(xì)菌型微生物總DNA的提取

使用DNeasy blood & tissue kit（Qiagen）試劑盒提取褐飛虱唾液濃縮物中的細(xì)菌型微生物總DNA，參照使用說明書操作。

1.4細(xì)菌型微生物16S rRNA文庫的建立和分析

將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接于pTA2載體（TOYOBO）上；使用大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，檢測(cè)陽性克隆的插入片段，選擇插入片段為1.5kb大小左右的克隆。以27F/1492R擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用4 bp的限制性內(nèi)切酶HhaⅠ、RsaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ對(duì)27F/1 492R擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切，酶切體系為20 μL，酶切條件為37 ℃酶切3 h。然后使用2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)酶切帶譜并分類，選擇克隆并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5使用透射電鏡觀察褐飛虱取食點(diǎn)周圍和口針鞘內(nèi)部的菌群

2結(jié)果與分析

2.1褐飛虱唾液分泌物中細(xì)菌型微生物的分析

3結(jié)論與討論

褐飛虱在對(duì)水稻進(jìn)行取食時(shí)，與水稻之間的相互作用機(jī)制是非常復(fù)雜的，褐飛虱的唾液在取食過程中所起的作用也是重要的研究對(duì)象[15]。本研究收集了褐飛虱水溶性唾液分泌物，并對(duì)唾液分泌物中的微生物組成進(jìn)行了分析，結(jié)果檢測(cè)到6種細(xì)菌型微生物。研究還對(duì)褐飛虱取食后殘留口針鞘中的細(xì)菌型微生物進(jìn)行了電鏡觀察，檢測(cè)到褐飛虱殘留在葉鞘中的口針鞘內(nèi)部與褐飛虱取食點(diǎn)附近均有微生物的存在。但是關(guān)于這些微生物的種類、與唾液分泌物中檢測(cè)到的細(xì)菌型微生物的關(guān)系等問題還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]程遐年，吳進(jìn)才，馬飛. 褐飛虱研究與防治[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003：1-16.

[2]Sōgawa K. The rice brown planthopper：feeding physiology and host plant interactions[J]. Annual Review of Entomology，1982，27：49-73.

[3]Hao P Y，Liu C X，Wang Y Y，et al. Herbivore-induced callose deposition on the sieve plates of rice：an important mechanism for host resistance[J]. Plant Physiology，2008，146（4）：1810-1820.

[4]Wang Y C，Tang M，Hao P Y，et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths[J]. Entomologia Experimentalis et Applicata，2008，129（3）：295-307.

[5]Baumann P. Biology bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects[J]. Annual Review of Microbiology，2005，59：155-189.

[6]Sasaki T，Kawamura M，Ishikawa H. Nitrogen recycling in the brown planthopper，Nilaparvata lugens：involvement of yeast-like endosymbionts in uric acid metabolism[J]. Journal of Insect Physiology，1996，42（2）：125-129.

[7]王國(guó)超，傅強(qiáng)，賴?guó)P香，等. 褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌與氨基酸營(yíng)養(yǎng)的關(guān)系[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，2005，48（4）：483-490.

[8]呂仲賢，俞曉平，陳建明，等. 共生菌在褐飛虱致害性變化中的作用[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，2001，44（2）：197-204.

[9]Tang M，Lv L，Jing S L，et al. Bacterial symbionts of the brown planthopper，Nilaparvata lugens（Homoptera：Delphacidae）[J]. Applied and Environmental Microbiology，2010，76（6）：1740-1745.

[10]王渭霞，羅舉，賴?guó)P香，等. 水稻褐飛虱內(nèi)生共生細(xì)菌Arsenophonus的鑒定和系統(tǒng)分析[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，2010，53（6）：647-654.

[11]李香香，楊焊，王志偉，等. 褐飛虱腸道細(xì)菌多樣性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（1）：126-129.

[12]Weisburg W G，Barns S M，Pelletier D A，et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology，1991，173（2）：697-703.

[13]Cole J R，Chai B，F(xiàn)arris R J，et al. The ribosomal database project（RDP-Ⅱ）：sequences and tools for high-throughput rRNA analysis[J]. Nucleic Acids Research，2005，33：294-296.

[14]Schloss P D，Handelsman J. Introducing DOTUR，a computer program for defining operational taxonomic units and estimating species richness[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（3）：1501-1506.

[15]Cheng X Y，Zhu L L，He G C. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper[J]. Molecular Plant，2013，6（3）：621-634.

[16]Mano H，Morisaki H. Endophytic bacteria in the rice plant[J]. Microbes and Environments，2008，23（2）：109-117.

[17]Kaga H，Mano H，Tanaka F，et al. Rice seeds as sources of endophytic bacteria[J]. Microbes and Environments，2009，24（2）：154-162.

1.3唾液分泌物中細(xì)菌型微生物總DNA的提取

使用DNeasy blood & tissue kit（Qiagen）試劑盒提取褐飛虱唾液濃縮物中的細(xì)菌型微生物總DNA，參照使用說明書操作。

1.4細(xì)菌型微生物16S rRNA文庫的建立和分析

將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接于pTA2載體（TOYOBO）上；使用大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，檢測(cè)陽性克隆的插入片段，選擇插入片段為1.5kb大小左右的克隆。以27F/1492R擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用4 bp的限制性內(nèi)切酶HhaⅠ、RsaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ對(duì)27F/1 492R擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切，酶切體系為20 μL，酶切條件為37 ℃酶切3 h。然后使用2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)酶切帶譜并分類，選擇克隆并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5使用透射電鏡觀察褐飛虱取食點(diǎn)周圍和口針鞘內(nèi)部的菌群

2結(jié)果與分析

2.1褐飛虱唾液分泌物中細(xì)菌型微生物的分析

3結(jié)論與討論

褐飛虱在對(duì)水稻進(jìn)行取食時(shí)，與水稻之間的相互作用機(jī)制是非常復(fù)雜的，褐飛虱的唾液在取食過程中所起的作用也是重要的研究對(duì)象[15]。本研究收集了褐飛虱水溶性唾液分泌物，并對(duì)唾液分泌物中的微生物組成進(jìn)行了分析，結(jié)果檢測(cè)到6種細(xì)菌型微生物。研究還對(duì)褐飛虱取食后殘留口針鞘中的細(xì)菌型微生物進(jìn)行了電鏡觀察，檢測(cè)到褐飛虱殘留在葉鞘中的口針鞘內(nèi)部與褐飛虱取食點(diǎn)附近均有微生物的存在。但是關(guān)于這些微生物的種類、與唾液分泌物中檢測(cè)到的細(xì)菌型微生物的關(guān)系等問題還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]程遐年，吳進(jìn)才，馬飛. 褐飛虱研究與防治[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003：1-16.

[2]Sōgawa K. The rice brown planthopper：feeding physiology and host plant interactions[J]. Annual Review of Entomology，1982，27：49-73.

[3]Hao P Y，Liu C X，Wang Y Y，et al. Herbivore-induced callose deposition on the sieve plates of rice：an important mechanism for host resistance[J]. Plant Physiology，2008，146（4）：1810-1820.

[4]Wang Y C，Tang M，Hao P Y，et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths[J]. Entomologia Experimentalis et Applicata，2008，129（3）：295-307.

[5]Baumann P. Biology bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects[J]. Annual Review of Microbiology，2005，59：155-189.

[6]Sasaki T，Kawamura M，Ishikawa H. Nitrogen recycling in the brown planthopper，Nilaparvata lugens：involvement of yeast-like endosymbionts in uric acid metabolism[J]. Journal of Insect Physiology，1996，42（2）：125-129.

[7]王國(guó)超，傅強(qiáng)，賴?guó)P香，等. 褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌與氨基酸營(yíng)養(yǎng)的關(guān)系[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，2005，48（4）：483-490.

[8]呂仲賢，俞曉平，陳建明，等. 共生菌在褐飛虱致害性變化中的作用[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，2001，44（2）：197-204.

[9]Tang M，Lv L，Jing S L，et al. Bacterial symbionts of the brown planthopper，Nilaparvata lugens（Homoptera：Delphacidae）[J]. Applied and Environmental Microbiology，2010，76（6）：1740-1745.

[10]王渭霞，羅舉，賴?guó)P香，等. 水稻褐飛虱內(nèi)生共生細(xì)菌Arsenophonus的鑒定和系統(tǒng)分析[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，2010，53（6）：647-654.

[11]李香香，楊焊，王志偉，等. 褐飛虱腸道細(xì)菌多樣性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（1）：126-129.

[12]Weisburg W G，Barns S M，Pelletier D A，et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology，1991，173（2）：697-703.

[13]Cole J R，Chai B，F(xiàn)arris R J，et al. The ribosomal database project（RDP-Ⅱ）：sequences and tools for high-throughput rRNA analysis[J]. Nucleic Acids Research，2005，33：294-296.

[14]Schloss P D，Handelsman J. Introducing DOTUR，a computer program for defining operational taxonomic units and estimating species richness[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（3）：1501-1506.

[15]Cheng X Y，Zhu L L，He G C. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper[J]. Molecular Plant，2013，6（3）：621-634.

[16]Mano H，Morisaki H. Endophytic bacteria in the rice plant[J]. Microbes and Environments，2008，23（2）：109-117.

[17]Kaga H，Mano H，Tanaka F，et al. Rice seeds as sources of endophytic bacteria[J]. Microbes and Environments，2009，24（2）：154-162.

1.3唾液分泌物中細(xì)菌型微生物總DNA的提取

使用DNeasy blood & tissue kit（Qiagen）試劑盒提取褐飛虱唾液濃縮物中的細(xì)菌型微生物總DNA，參照使用說明書操作。

1.4細(xì)菌型微生物16S rRNA文庫的建立和分析

將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接于pTA2載體（TOYOBO）上；使用大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，檢測(cè)陽性克隆的插入片段，選擇插入片段為1.5kb大小左右的克隆。以27F/1492R擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用4 bp的限制性內(nèi)切酶HhaⅠ、RsaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ對(duì)27F/1 492R擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切，酶切體系為20 μL，酶切條件為37 ℃酶切3 h。然后使用2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)酶切帶譜并分類，選擇克隆并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5使用透射電鏡觀察褐飛虱取食點(diǎn)周圍和口針鞘內(nèi)部的菌群

2結(jié)果與分析

2.1褐飛虱唾液分泌物中細(xì)菌型微生物的分析

3結(jié)論與討論

褐飛虱在對(duì)水稻進(jìn)行取食時(shí)，與水稻之間的相互作用機(jī)制是非常復(fù)雜的，褐飛虱的唾液在取食過程中所起的作用也是重要的研究對(duì)象[15]。本研究收集了褐飛虱水溶性唾液分泌物，并對(duì)唾液分泌物中的微生物組成進(jìn)行了分析，結(jié)果檢測(cè)到6種細(xì)菌型微生物。研究還對(duì)褐飛虱取食后殘留口針鞘中的細(xì)菌型微生物進(jìn)行了電鏡觀察，檢測(cè)到褐飛虱殘留在葉鞘中的口針鞘內(nèi)部與褐飛虱取食點(diǎn)附近均有微生物的存在。但是關(guān)于這些微生物的種類、與唾液分泌物中檢測(cè)到的細(xì)菌型微生物的關(guān)系等問題還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]程遐年，吳進(jìn)才，馬飛. 褐飛虱研究與防治[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003：1-16.

[2]Sōgawa K. The rice brown planthopper：feeding physiology and host plant interactions[J]. Annual Review of Entomology，1982，27：49-73.

[3]Hao P Y，Liu C X，Wang Y Y，et al. Herbivore-induced callose deposition on the sieve plates of rice：an important mechanism for host resistance[J]. Plant Physiology，2008，146（4）：1810-1820.

[4]Wang Y C，Tang M，Hao P Y，et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths[J]. Entomologia Experimentalis et Applicata，2008，129（3）：295-307.

[5]Baumann P. Biology bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects[J]. Annual Review of Microbiology，2005，59：155-189.

[6]Sasaki T，Kawamura M，Ishikawa H. Nitrogen recycling in the brown planthopper，Nilaparvata lugens：involvement of yeast-like endosymbionts in uric acid metabolism[J]. Journal of Insect Physiology，1996，42（2）：125-129.

[7]王國(guó)超，傅強(qiáng)，賴?guó)P香，等. 褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌與氨基酸營(yíng)養(yǎng)的關(guān)系[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，2005，48（4）：483-490.

[8]呂仲賢，俞曉平，陳建明，等. 共生菌在褐飛虱致害性變化中的作用[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，2001，44（2）：197-204.

[9]Tang M，Lv L，Jing S L，et al. Bacterial symbionts of the brown planthopper，Nilaparvata lugens（Homoptera：Delphacidae）[J]. Applied and Environmental Microbiology，2010，76（6）：1740-1745.

[10]王渭霞，羅舉，賴?guó)P香，等. 水稻褐飛虱內(nèi)生共生細(xì)菌Arsenophonus的鑒定和系統(tǒng)分析[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，2010，53（6）：647-654.

[11]李香香，楊焊，王志偉，等. 褐飛虱腸道細(xì)菌多樣性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（1）：126-129.

[12]Weisburg W G，Barns S M，Pelletier D A，et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology，1991，173（2）：697-703.

[13]Cole J R，Chai B，F(xiàn)arris R J，et al. The ribosomal database project（RDP-Ⅱ）：sequences and tools for high-throughput rRNA analysis[J]. Nucleic Acids Research，2005，33：294-296.

[14]Schloss P D，Handelsman J. Introducing DOTUR，a computer program for defining operational taxonomic units and estimating species richness[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（3）：1501-1506.

[15]Cheng X Y，Zhu L L，He G C. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper[J]. Molecular Plant，2013，6（3）：621-634.

[16]Mano H，Morisaki H. Endophytic bacteria in the rice plant[J]. Microbes and Environments，2008，23（2）：109-117.

[17]Kaga H，Mano H，Tanaka F，et al. Rice seeds as sources of endophytic bacteria[J]. Microbes and Environments，2009，24（2）：154-162.