胚乳淀粉體分離的簡易方法
2014-07-11 04:10:22荊彥平等
江蘇農業科學 2014年4期
荊彥平等
摘要：以小麥、玉米為材料分離胚乳淀粉體，采用切割胚乳、低速離心法從胚乳中分離出淀粉體，利用0.5% I2-KI溶液對淀粉體進行染色，結果表明，小麥胚乳淀粉體呈近圓球形或橢球形，玉米胚乳淀粉體呈圓球形。玉米胚乳淀粉體形狀較規則，淀粉體長、短軸差異較小，圓度較高。小麥胚乳淀粉體形狀變化比較大，淀粉體長、短軸值差異較大，圓度較低。
關鍵詞：小麥；玉米；胚乳；淀粉體；低速離心
中圖分類號： S512.101 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0073-02
收稿日期：2013-08-07
基金項目：國家自然科學基金（編號：3107134、 31270228）； 高等學校博士學科點專項科研基金（編號：2009320004）。
作者簡介：荊彥平（1989—），男，碩士研究生，從事谷物胚乳發育研究。E-mail： jingyanping1989@163.com。
通信作者：王忠，教授，從事植物生理學研究。E-mail： wangzhong@yzu.edu.cn。胚乳是由3倍體胚乳原核經反復分裂發育而來的營養組織，是谷物籽粒的重要組成部分。胚乳重量約占谷物重量的80%以上，胚乳富含淀粉、蛋白質、脂質、礦質元素等物質，其中淀粉約占谷物籽粒干重的65%～70%。淀粉體的發育狀況及內部淀粉的積累量影響谷物的產量及品質[1-2]。近年來，學者們從形態結構、生理生化、分子遺傳等方面對淀粉體進行了廣泛研究，利用電子顯微技術觀察并確定了淀粉體的結構。簡易方便的淀粉體分離技術對深入研究淀粉體尤為重要。Echeverria等先從玉米胚乳組織中誘導培養出前質體，然后從前質體中分離出了淀粉體[3]。Tetlow等利用低速離心法從小麥胚乳組織中分離出了完整的淀粉體[4]。本研究對淀粉體分離過程進行了簡化，從小麥、玉米胚乳中分離出了淀粉體，并對其進行了顯微拍照，旨在為分離胚乳淀粉體提供依據。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1材料以鄭麥9023、農樂988花后12 d的穎果為材料。
1.1.2儀器2 mL吸管、鑷子、解剖針、雙面刀片、培養皿、400目尼龍紗布、漏斗、5 mL離心管、燒杯、量筒、200 μL移液槍、1 000 mL容量瓶、分析天平、冷凍臺式離心機、普通光學顯微鏡、偏振光顯微鏡。
1.2試劑
1.2.1淀粉體分離液以蒸餾水為作為溶劑，每升溶液含有50 mmol Tris、0.8 mol蔗糖、1 mmol EDTA二鈉、1 mmol KCl、2 mmol MgCl2，利用1 mol/L HCl調節溶液pH值至7.5。將新配制的溶液置于4 ℃避光條件下（最多1周），分離淀粉體時，向溶液中滴加1 g牛血清蛋白（BSA）及2 mmol巰基乙醇。
1.2.2淀粉體染液0.5% I2-KI溶液（取1g KI溶于5～10 mL 蒸餾水中，加0.5 g I2至完全溶解，加蒸餾水至300 mL）。
1.3方法
1.3.1取材分別取小麥與玉米穎果10～20粒，剝除果皮、種皮、胚，將胚乳放在培養皿中，滴加5 mL分離液，冰浴中預冷30～60 min。
1.3.2提取倒掉分離液，用雙面刀片將胚乳切割成細小顆粒，重新滴加2 mL分離液，冰浴靜置1 h，用吸管吸取胚乳周圍的勻漿，用400目紗布過濾后置于5 mL離心管中。向胚乳顆粒中重新滴加1 mL分離液，重復上述步驟2～3次。
1.3.3離心將濾液在100 g 4 ℃下離心10 min，倒掉上清液，滴加5 mL分離液，緩慢翻轉離心管，使沉淀懸浮，重新離心1～2次。離心后，所得沉淀即為淀粉體，在沉淀中滴加 2 mL 分離液使其懸浮。
1.3.4染色吸取2～3滴淀粉體懸浮液于指形管中，滴加1滴0.5% I2-KI溶液，染色5 min。
1.3.5拍照分別吸取1滴未染色與染色的淀粉體懸浮液涂布于載玻片上，加蓋玻片，置于光學顯微鏡與偏振光顯微鏡下觀察并拍照。
1.4數據分析
利用ImageJ軟件分析顯微圖片中淀粉體的表面幾何特性，用Excel軟件分析數據。
2結果與分析
小麥、玉米胚乳淀粉體均為單粒淀粉體，即1個淀粉體內只含有1個淀粉粒（圖1）。2種作物淀粉體被I2-KI溶液染色后呈深藍色，說明淀粉體內淀粉主要以直鏈淀粉為主。淀粉體在偏振光顯微鏡下呈“十”字構型，淀粉體內的淀粉具有球晶結構特性。玉米胚乳淀粉體可通過“出芽”（淀粉被膜外凸形成小淀粉體）及 “分裂”（淀粉體內部形成隔板并分裂成幾個單體）的方式進行增殖。小麥胚乳淀粉體呈近圓球形或橢球形，玉米胚乳淀粉體呈圓球形（圖1）。玉米胚乳淀粉體形狀較規則，淀粉體長、短軸差異較小，圓度較高。小麥胚乳淀粉體形狀變化比較大，淀粉體長、短軸值差異較大，圓度較低（表1）。
3結論與討論
本研究從小麥、玉米穎果中分離出淀粉體，淀粉體內富含密度較大的淀粉粒，淀粉體在分離過程中容易破裂。因此在分離過程中應注意以下事項：利用切割法代替研磨法使胚乳釋放出淀粉體。分離葉綠體時通常采用研磨方式粉碎植物組織，釋放葉綠體[5]。淀粉體分離過程中采用研磨方式容易使淀粉體破裂；分離過程中動作應當緩慢，避免損傷淀粉體；離心之前先用400目尼龍紗布過濾勻漿，去除胚乳組織碎片、完整的細胞以及體積較大的細胞器，淀粉體及小的細胞器可以通過；低速離心，提高淀粉體的純度。淀粉體密度較大，低速離心時優先沉降，其他小細胞器、蛋白質等不發生沉降，殘留在上清液中，多次離心后可去除雜質，提高純度。利用切片技術觀察淀粉體的結構，實際觀察結果為淀粉體的橫切面，切片制作過程復雜耗時。利用分離技術將淀粉體從胚乳組織中分離，可以直接觀察淀粉體的完整形態，操作簡便省時。
利用I2-KI溶液染色及顯微觀察可以對淀粉體的分離進行定性鑒定，如果要在分離的基礎上繼續對淀粉體的代謝機理及遺傳表達展開研究，首先要對分離結果進行定量測定。測量指標有分離純度、完整度及產量。測定分離產物中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、乙醇脫氫酶、延胡索酸酶、檸檬酸合成酶等酶的活性來驗證細胞質、線粒體、內質網以及過氧化物酶體等小型細胞器的殘余量，用以檢測淀粉體分離純度。測定淀粉體內的標志性酶如腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、堿性磷酸酶的活性與含量來檢測淀粉體的完整性與產量。
參考文獻：
[1]Sabelli P A，Larkins B A. The development of endosperm in grasses[J]. Plant Physiology，2009，149：14-26.
[2]蔡瑞國，尹燕枰，趙發茂，等. 強筋小麥胚乳淀粉粒度分布特征及其對弱光的響應[J]. 中國農業科學，2008，41（5）：1308-1316.
[3]Echeverria E，Boyer C，Liu K C，et al. Isolation of amyloplasts from developing maize endosperm[J]. Plant Physiology，1985，77（3）：513-519.
[4]Tetlow I J，Blissett K J，Emes M J. A rapid method for the isolation of purified amyloplasts from wheat endosperm[J]. Planta，1993，189（4）：597-600.
[5]孔祥生，易現峰. 植物生理學實驗技術[M]. 北京：中國農業出版社，2008：83-84.
摘要：以小麥、玉米為材料分離胚乳淀粉體，采用切割胚乳、低速離心法從胚乳中分離出淀粉體，利用0.5% I2-KI溶液對淀粉體進行染色，結果表明，小麥胚乳淀粉體呈近圓球形或橢球形，玉米胚乳淀粉體呈圓球形。玉米胚乳淀粉體形狀較規則，淀粉體長、短軸差異較小，圓度較高。小麥胚乳淀粉體形狀變化比較大，淀粉體長、短軸值差異較大，圓度較低。
關鍵詞：小麥；玉米；胚乳；淀粉體；低速離心
中圖分類號： S512.101 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0073-02
收稿日期：2013-08-07
基金項目：國家自然科學基金（編號：3107134、 31270228）； 高等學校博士學科點專項科研基金（編號：2009320004）。
作者簡介：荊彥平（1989—），男，碩士研究生，從事谷物胚乳發育研究。E-mail： jingyanping1989@163.com。
通信作者：王忠，教授，從事植物生理學研究。E-mail： wangzhong@yzu.edu.cn。胚乳是由3倍體胚乳原核經反復分裂發育而來的營養組織，是谷物籽粒的重要組成部分。胚乳重量約占谷物重量的80%以上，胚乳富含淀粉、蛋白質、脂質、礦質元素等物質，其中淀粉約占谷物籽粒干重的65%～70%。淀粉體的發育狀況及內部淀粉的積累量影響谷物的產量及品質[1-2]。近年來，學者們從形態結構、生理生化、分子遺傳等方面對淀粉體進行了廣泛研究，利用電子顯微技術觀察并確定了淀粉體的結構。簡易方便的淀粉體分離技術對深入研究淀粉體尤為重要。Echeverria等先從玉米胚乳組織中誘導培養出前質體，然后從前質體中分離出了淀粉體[3]。Tetlow等利用低速離心法從小麥胚乳組織中分離出了完整的淀粉體[4]。本研究對淀粉體分離過程進行了簡化，從小麥、玉米胚乳中分離出了淀粉體，并對其進行了顯微拍照，旨在為分離胚乳淀粉體提供依據。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1材料以鄭麥9023、農樂988花后12 d的穎果為材料。
1.1.2儀器2 mL吸管、鑷子、解剖針、雙面刀片、培養皿、400目尼龍紗布、漏斗、5 mL離心管、燒杯、量筒、200 μL移液槍、1 000 mL容量瓶、分析天平、冷凍臺式離心機、普通光學顯微鏡、偏振光顯微鏡。
1.2試劑
1.2.1淀粉體分離液以蒸餾水為作為溶劑，每升溶液含有50 mmol Tris、0.8 mol蔗糖、1 mmol EDTA二鈉、1 mmol KCl、2 mmol MgCl2，利用1 mol/L HCl調節溶液pH值至7.5。將新配制的溶液置于4 ℃避光條件下（最多1周），分離淀粉體時，向溶液中滴加1 g牛血清蛋白（BSA）及2 mmol巰基乙醇。
1.2.2淀粉體染液0.5% I2-KI溶液（取1g KI溶于5～10 mL 蒸餾水中，加0.5 g I2至完全溶解，加蒸餾水至300 mL）。
1.3方法
1.3.1取材分別取小麥與玉米穎果10～20粒，剝除果皮、種皮、胚，將胚乳放在培養皿中，滴加5 mL分離液，冰浴中預冷30～60 min。
1.3.2提取倒掉分離液，用雙面刀片將胚乳切割成細小顆粒，重新滴加2 mL分離液，冰浴靜置1 h，用吸管吸取胚乳周圍的勻漿，用400目紗布過濾后置于5 mL離心管中。向胚乳顆粒中重新滴加1 mL分離液，重復上述步驟2～3次。
1.3.3離心將濾液在100 g 4 ℃下離心10 min，倒掉上清液，滴加5 mL分離液，緩慢翻轉離心管，使沉淀懸浮，重新離心1～2次。離心后，所得沉淀即為淀粉體，在沉淀中滴加 2 mL 分離液使其懸浮。
1.3.4染色吸取2～3滴淀粉體懸浮液于指形管中，滴加1滴0.5% I2-KI溶液，染色5 min。
1.3.5拍照分別吸取1滴未染色與染色的淀粉體懸浮液涂布于載玻片上，加蓋玻片，置于光學顯微鏡與偏振光顯微鏡下觀察并拍照。
1.4數據分析
利用ImageJ軟件分析顯微圖片中淀粉體的表面幾何特性，用Excel軟件分析數據。
2結果與分析
小麥、玉米胚乳淀粉體均為單粒淀粉體，即1個淀粉體內只含有1個淀粉粒（圖1）。2種作物淀粉體被I2-KI溶液染色后呈深藍色，說明淀粉體內淀粉主要以直鏈淀粉為主。淀粉體在偏振光顯微鏡下呈“十”字構型，淀粉體內的淀粉具有球晶結構特性。玉米胚乳淀粉體可通過“出芽”（淀粉被膜外凸形成小淀粉體）及 “分裂”（淀粉體內部形成隔板并分裂成幾個單體）的方式進行增殖。小麥胚乳淀粉體呈近圓球形或橢球形，玉米胚乳淀粉體呈圓球形（圖1）。玉米胚乳淀粉體形狀較規則，淀粉體長、短軸差異較小，圓度較高。小麥胚乳淀粉體形狀變化比較大，淀粉體長、短軸值差異較大，圓度較低（表1）。
3結論與討論
本研究從小麥、玉米穎果中分離出淀粉體，淀粉體內富含密度較大的淀粉粒，淀粉體在分離過程中容易破裂。因此在分離過程中應注意以下事項：利用切割法代替研磨法使胚乳釋放出淀粉體。分離葉綠體時通常采用研磨方式粉碎植物組織，釋放葉綠體[5]。淀粉體分離過程中采用研磨方式容易使淀粉體破裂；分離過程中動作應當緩慢，避免損傷淀粉體；離心之前先用400目尼龍紗布過濾勻漿，去除胚乳組織碎片、完整的細胞以及體積較大的細胞器，淀粉體及小的細胞器可以通過；低速離心，提高淀粉體的純度。淀粉體密度較大，低速離心時優先沉降，其他小細胞器、蛋白質等不發生沉降，殘留在上清液中，多次離心后可去除雜質，提高純度。利用切片技術觀察淀粉體的結構，實際觀察結果為淀粉體的橫切面，切片制作過程復雜耗時。利用分離技術將淀粉體從胚乳組織中分離，可以直接觀察淀粉體的完整形態，操作簡便省時。
利用I2-KI溶液染色及顯微觀察可以對淀粉體的分離進行定性鑒定，如果要在分離的基礎上繼續對淀粉體的代謝機理及遺傳表達展開研究，首先要對分離結果進行定量測定。測量指標有分離純度、完整度及產量。測定分離產物中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、乙醇脫氫酶、延胡索酸酶、檸檬酸合成酶等酶的活性來驗證細胞質、線粒體、內質網以及過氧化物酶體等小型細胞器的殘余量，用以檢測淀粉體分離純度。測定淀粉體內的標志性酶如腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、堿性磷酸酶的活性與含量來檢測淀粉體的完整性與產量。
參考文獻：
[1]Sabelli P A，Larkins B A. The development of endosperm in grasses[J]. Plant Physiology，2009，149：14-26.
[2]蔡瑞國，尹燕枰，趙發茂，等. 強筋小麥胚乳淀粉粒度分布特征及其對弱光的響應[J]. 中國農業科學，2008，41（5）：1308-1316.
[3]Echeverria E，Boyer C，Liu K C，et al. Isolation of amyloplasts from developing maize endosperm[J]. Plant Physiology，1985，77（3）：513-519.
[4]Tetlow I J，Blissett K J，Emes M J. A rapid method for the isolation of purified amyloplasts from wheat endosperm[J]. Planta，1993，189（4）：597-600.
[5]孔祥生，易現峰. 植物生理學實驗技術[M]. 北京：中國農業出版社，2008：83-84.
摘要：以小麥、玉米為材料分離胚乳淀粉體，采用切割胚乳、低速離心法從胚乳中分離出淀粉體，利用0.5% I2-KI溶液對淀粉體進行染色，結果表明，小麥胚乳淀粉體呈近圓球形或橢球形，玉米胚乳淀粉體呈圓球形。玉米胚乳淀粉體形狀較規則，淀粉體長、短軸差異較小，圓度較高。小麥胚乳淀粉體形狀變化比較大，淀粉體長、短軸值差異較大，圓度較低。
關鍵詞：小麥；玉米；胚乳；淀粉體；低速離心
中圖分類號： S512.101 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0073-02
收稿日期：2013-08-07
基金項目：國家自然科學基金（編號：3107134、 31270228）； 高等學校博士學科點專項科研基金（編號：2009320004）。
作者簡介：荊彥平（1989—），男，碩士研究生，從事谷物胚乳發育研究。E-mail： jingyanping1989@163.com。
通信作者：王忠，教授，從事植物生理學研究。E-mail： wangzhong@yzu.edu.cn。胚乳是由3倍體胚乳原核經反復分裂發育而來的營養組織，是谷物籽粒的重要組成部分。胚乳重量約占谷物重量的80%以上，胚乳富含淀粉、蛋白質、脂質、礦質元素等物質，其中淀粉約占谷物籽粒干重的65%～70%。淀粉體的發育狀況及內部淀粉的積累量影響谷物的產量及品質[1-2]。近年來，學者們從形態結構、生理生化、分子遺傳等方面對淀粉體進行了廣泛研究，利用電子顯微技術觀察并確定了淀粉體的結構。簡易方便的淀粉體分離技術對深入研究淀粉體尤為重要。Echeverria等先從玉米胚乳組織中誘導培養出前質體，然后從前質體中分離出了淀粉體[3]。Tetlow等利用低速離心法從小麥胚乳組織中分離出了完整的淀粉體[4]。本研究對淀粉體分離過程進行了簡化，從小麥、玉米胚乳中分離出了淀粉體，并對其進行了顯微拍照，旨在為分離胚乳淀粉體提供依據。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1材料以鄭麥9023、農樂988花后12 d的穎果為材料。
1.1.2儀器2 mL吸管、鑷子、解剖針、雙面刀片、培養皿、400目尼龍紗布、漏斗、5 mL離心管、燒杯、量筒、200 μL移液槍、1 000 mL容量瓶、分析天平、冷凍臺式離心機、普通光學顯微鏡、偏振光顯微鏡。
1.2試劑
1.2.1淀粉體分離液以蒸餾水為作為溶劑，每升溶液含有50 mmol Tris、0.8 mol蔗糖、1 mmol EDTA二鈉、1 mmol KCl、2 mmol MgCl2，利用1 mol/L HCl調節溶液pH值至7.5。將新配制的溶液置于4 ℃避光條件下（最多1周），分離淀粉體時，向溶液中滴加1 g牛血清蛋白（BSA）及2 mmol巰基乙醇。
1.2.2淀粉體染液0.5% I2-KI溶液（取1g KI溶于5～10 mL 蒸餾水中，加0.5 g I2至完全溶解，加蒸餾水至300 mL）。
1.3方法
1.3.1取材分別取小麥與玉米穎果10～20粒，剝除果皮、種皮、胚，將胚乳放在培養皿中，滴加5 mL分離液，冰浴中預冷30～60 min。
1.3.2提取倒掉分離液，用雙面刀片將胚乳切割成細小顆粒，重新滴加2 mL分離液，冰浴靜置1 h，用吸管吸取胚乳周圍的勻漿，用400目紗布過濾后置于5 mL離心管中。向胚乳顆粒中重新滴加1 mL分離液，重復上述步驟2～3次。
1.3.3離心將濾液在100 g 4 ℃下離心10 min，倒掉上清液，滴加5 mL分離液，緩慢翻轉離心管，使沉淀懸浮，重新離心1～2次。離心后，所得沉淀即為淀粉體，在沉淀中滴加 2 mL 分離液使其懸浮。
1.3.4染色吸取2～3滴淀粉體懸浮液于指形管中，滴加1滴0.5% I2-KI溶液，染色5 min。
1.3.5拍照分別吸取1滴未染色與染色的淀粉體懸浮液涂布于載玻片上，加蓋玻片，置于光學顯微鏡與偏振光顯微鏡下觀察并拍照。
1.4數據分析
利用ImageJ軟件分析顯微圖片中淀粉體的表面幾何特性，用Excel軟件分析數據。
2結果與分析
小麥、玉米胚乳淀粉體均為單粒淀粉體，即1個淀粉體內只含有1個淀粉粒（圖1）。2種作物淀粉體被I2-KI溶液染色后呈深藍色，說明淀粉體內淀粉主要以直鏈淀粉為主。淀粉體在偏振光顯微鏡下呈“十”字構型，淀粉體內的淀粉具有球晶結構特性。玉米胚乳淀粉體可通過“出芽”（淀粉被膜外凸形成小淀粉體）及 “分裂”（淀粉體內部形成隔板并分裂成幾個單體）的方式進行增殖。小麥胚乳淀粉體呈近圓球形或橢球形，玉米胚乳淀粉體呈圓球形（圖1）。玉米胚乳淀粉體形狀較規則，淀粉體長、短軸差異較小，圓度較高。小麥胚乳淀粉體形狀變化比較大，淀粉體長、短軸值差異較大，圓度較低（表1）。
3結論與討論
本研究從小麥、玉米穎果中分離出淀粉體，淀粉體內富含密度較大的淀粉粒，淀粉體在分離過程中容易破裂。因此在分離過程中應注意以下事項：利用切割法代替研磨法使胚乳釋放出淀粉體。分離葉綠體時通常采用研磨方式粉碎植物組織，釋放葉綠體[5]。淀粉體分離過程中采用研磨方式容易使淀粉體破裂；分離過程中動作應當緩慢，避免損傷淀粉體；離心之前先用400目尼龍紗布過濾勻漿，去除胚乳組織碎片、完整的細胞以及體積較大的細胞器，淀粉體及小的細胞器可以通過；低速離心，提高淀粉體的純度。淀粉體密度較大，低速離心時優先沉降，其他小細胞器、蛋白質等不發生沉降，殘留在上清液中，多次離心后可去除雜質，提高純度。利用切片技術觀察淀粉體的結構，實際觀察結果為淀粉體的橫切面，切片制作過程復雜耗時。利用分離技術將淀粉體從胚乳組織中分離，可以直接觀察淀粉體的完整形態，操作簡便省時。
利用I2-KI溶液染色及顯微觀察可以對淀粉體的分離進行定性鑒定，如果要在分離的基礎上繼續對淀粉體的代謝機理及遺傳表達展開研究，首先要對分離結果進行定量測定。測量指標有分離純度、完整度及產量。測定分離產物中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、乙醇脫氫酶、延胡索酸酶、檸檬酸合成酶等酶的活性來驗證細胞質、線粒體、內質網以及過氧化物酶體等小型細胞器的殘余量，用以檢測淀粉體分離純度。測定淀粉體內的標志性酶如腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、堿性磷酸酶的活性與含量來檢測淀粉體的完整性與產量。
參考文獻：
[1]Sabelli P A，Larkins B A. The development of endosperm in grasses[J]. Plant Physiology，2009，149：14-26.
[2]蔡瑞國，尹燕枰，趙發茂，等. 強筋小麥胚乳淀粉粒度分布特征及其對弱光的響應[J]. 中國農業科學，2008，41（5）：1308-1316.
[3]Echeverria E，Boyer C，Liu K C，et al. Isolation of amyloplasts from developing maize endosperm[J]. Plant Physiology，1985，77（3）：513-519.
[4]Tetlow I J，Blissett K J，Emes M J. A rapid method for the isolation of purified amyloplasts from wheat endosperm[J]. Planta，1993，189（4）：597-600.
[5]孔祥生，易現峰. 植物生理學實驗技術[M]. 北京：中國農業出版社，2008：83-84.
