甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥廣譜特異性多克隆抗體的親和純化

賀江　劉賢金

摘要：采用碳二亞胺法將甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥通用半抗原與瓊脂糖凝膠進(jìn)行鏈接，并利用鏈接產(chǎn)物對(duì)相應(yīng)的多克隆抗血清進(jìn)行純化。經(jīng)鑒定，偶聯(lián)反應(yīng)正常，純化效果良好且產(chǎn)率約為78.5%；純化后抗體能夠保持對(duì)5種農(nóng)藥對(duì)象的識(shí)別活性，且具有更高的親和活性。應(yīng)用純化后的抗體能夠建立起更靈敏的免疫檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：親和純化；甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥；廣譜特異性抗體；免疫分析

中圖分類號(hào)： TQ450.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）04-0033-03

收稿日期：2013-08-20

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30871658）。

作者簡介：賀江（1983—），男，江西萍鄉(xiāng)人，博士，講師，主要從事食品安全與食品生物技術(shù)研究。E-mail：hejiang1119@163.com。農(nóng)藥殘留作為食品安全問題中的重要方面之一，深受世界各國的普遍關(guān)注。建立有效的農(nóng)藥殘留監(jiān)測(cè)體系是對(duì)農(nóng)藥殘留問題進(jìn)行控制的前提與基礎(chǔ)，目前公認(rèn)的理想農(nóng)藥殘留監(jiān)測(cè)體系包括以農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)作為現(xiàn)場(chǎng)初篩工具、以農(nóng)藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法作為最終的定性定量確證工具[1]。免疫檢測(cè)技術(shù)是一種簡單、快速且靈敏的檢測(cè)方法，已被廣泛用于農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)[2-6]。抗體的特異性和親和力等特性是決定這類方法檢測(cè)效果的核心因素。基于動(dòng)物免疫的多克隆抗體[6-7]、基于雜交瘤技術(shù)的單克隆抗體[2，8]以及基于噬菌體展示等分子技術(shù)的重組抗體[9-10]等均已在農(nóng)藥免疫殘留檢測(cè)領(lǐng)域有應(yīng)用，但無論利用哪類抗體進(jìn)行免疫分析都存在一些會(huì)影響檢測(cè)效果的干擾物質(zhì)。例如，在多克隆抗血清中存在非特異性或者低親和力免疫球蛋白；雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液或小鼠腹水中存在白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白等宿主蛋白；而重組抗體中往往也同樣存在來自于宿主（如大腸桿菌）的各類蛋白。因此，在建立特異性強(qiáng)、檢測(cè)限低、線性范圍廣的免疫檢測(cè)技術(shù)時(shí)，往往需要結(jié)合抗體純化過程來實(shí)現(xiàn)[11-13]。對(duì)抗體進(jìn)行純化的方法很多，其中親和層析技術(shù)應(yīng)用最廣泛。關(guān)于應(yīng)用親和層析技術(shù)對(duì)抗體進(jìn)行純化的研究，已有學(xué)者進(jìn)行了深度的概述[14-16]。抗體親和純化效果主要取決于親和層析柱上所固定的配體。基于A蛋白和G蛋白的抗體親和純化技術(shù)研究引用最廣泛，除此之外，基于組氨酸、金屬離子、植物凝集素等新型配體的親和層析技術(shù)也同樣被應(yīng)用于抗體的純化。然而，直接應(yīng)用固相抗原進(jìn)行相應(yīng)抗體的親和純化無疑是最有效的方法，尤其是對(duì)多克隆抗血清而言。筆者所在的課題組前期合成了甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥通用半抗原，并進(jìn)一步免疫了新西蘭大白兔，從而獲得了針對(duì)這類農(nóng)藥的廣譜特異性抗體[17]。本研究擬在此基礎(chǔ)上偶聯(lián)通用半抗原至瓊脂糖固相載體制備親和層析柱，并進(jìn)一步應(yīng)用于抗血清的純化。

1材料與方法

1.1材料與試劑

甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥廣譜特異性抗體（兔血清）、甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥通用半抗原、通用半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物（Hapten-OVA）等由筆者所在的實(shí)驗(yàn)室自行制備保存；碳二亞胺縮合劑99% 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）購自百靈威科技有限公司；氨基活化的瓊脂糖凝膠（EAH 瓊脂糖凝膠 4B）購自通用電氣醫(yī)療集團(tuán)；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）等購自Sigma公司；30～200 ku 蛋白Marker購自北京全式金生物有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；馬拉硫磷、樂果、稻豐散、亞胺硫磷、殺撲磷等農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（99.9%）購自中國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Agilent 1200型高效液相色譜儀、Agilent G6410A型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配ESI離子源）；DYY-31A 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、微型垂直電泳槽（北京六一儀器廠）；微量紫外可見分光光度計(jì)（通用電氣醫(yī)療集團(tuán)）；MK2酶標(biāo)儀、全自動(dòng)洗板機(jī)（Thermo Fisher）；其他實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器設(shè)備。

1.3方法

1.3.1甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥通用半抗原免疫親和柱的制備以EDC·HCl為偶聯(lián)劑，采用碳二亞胺法將帶有羧基活性基團(tuán)的甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥通用半抗原與帶有氨基活性基團(tuán)的EAH 瓊脂糖凝膠 4B 凝膠鏈接，反應(yīng)原理如圖1所示。取EAH 瓊脂糖凝膠 4B 5 mL，用超純水（pH值 4.5）和 0.5 mol/L NaCl 各交替洗滌3次；同時(shí)用5 mL 連接反應(yīng)液（50% 甲醇，pH 值4.5）溶解10.0 mg 通用半抗原；然后將二者混合，于冰浴中緩慢振搖反應(yīng)，反應(yīng)前1 h 分10 次加入EDC 溶液至終濃度為0.1 mol/L；冰浴中反應(yīng)過夜，將溫度逐漸升高至室溫，總反應(yīng)時(shí)間為24 h。反應(yīng)結(jié)束后，用0.1 mol/L 醋酸緩沖液（含0.5 mol/L NaCl，pH值 4.0）和0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液（含0.5 mol/L NaCl，pH值 8.0）交替洗滌連接產(chǎn)物各3次，最后用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇洗滌，并裝填成 1 mL 的親和柱備用。對(duì)照反應(yīng)中不加EDC，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的選擇離子監(jiān)測(cè)模式（selective ion monitoring，SIM）測(cè)定反應(yīng)后半抗原與副產(chǎn)物的量，進(jìn)而判斷反應(yīng)是否順利進(jìn)行。

1.3.2甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥廣譜特異性抗體的親和純化甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥廣譜特異性抗體經(jīng)飽和硫酸銨法初步純化，

再用自制的通用半抗原免疫親和柱進(jìn)一步純化。親和純化具體過程如下：以10 mL 結(jié)合緩沖液平衡親和柱；加入1 mL經(jīng)0.45 μm濾膜過濾的粗提抗體樣品，用結(jié)合緩沖液洗滌至流出液中無蛋白檢出；以4 mL 洗脫緩沖液洗脫目的抗體，并用加有中和緩沖液的小管收集；最后用5 mL 結(jié)合緩沖液洗滌親和柱。純化結(jié)束后，通過不連續(xù)體系非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定純化效果，間接非競(jìng)爭ELISA測(cè)定抗體純化后的活性。SDS-PAGE電泳操作過程參照相關(guān)試驗(yàn)手冊(cè)。間接非競(jìng)爭ELISA操作過程如下：（1）包被。用CBS緩沖液將Hapten-OVA包被原稀釋至2 μg/mL后加于96孔板中，100 μL/孔，4 ℃過夜。（2）封閉。用PBST洗板3次，加入200 μL/孔封閉液（含2% OVA的PBS溶液），37 ℃孵育 1 h。（3）加樣。用PBST洗板3次，將純化后的抗體樣品用PBS適當(dāng)稀釋后再加入微孔中，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h。（4）加酶標(biāo)二抗。用含2% OVA的PBS液將酶標(biāo)二抗稀釋 5 000 倍（工作濃度），100 μL/孔，37 ℃溫浴1 h。（5）顯色。加入TMB底物液100 μL/孔，顯色15 min，再加入50 μL/孔濃度為 2 mol/L的 H2SO4快速終止反應(yīng)，最后用酶標(biāo)儀讀取D450 nm。每個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)孔。

1.3.3抗體純化前后的特異性和親和力比較采用間接競(jìng)爭ELISA鑒定純化后抗體對(duì)馬拉硫磷、樂果、稻豐散、亞胺硫磷、殺撲磷等甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥的反應(yīng)活性，并與純化前抗體的反應(yīng)活性進(jìn)行比較，以判定純化過程對(duì)抗體廣譜特異性的影響。先用Hapten-OVA包被原包被并用OVA封閉96孔板，然后加入純化抗體和不同濃度的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行競(jìng)爭結(jié)合，后續(xù)加酶標(biāo)二抗、顯色等過程同前。計(jì)算純化抗體對(duì)各種農(nóng)藥對(duì)象的半抑制濃度（IC50），并以馬拉硫磷為基準(zhǔn)計(jì)算交叉反應(yīng)率。

2結(jié)果與分析

2.1甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥通用半抗原免疫親和柱的制備

由偶聯(lián)反應(yīng)機(jī)理可知，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)體系中的半抗原逐漸消耗，而同時(shí)伴隨著脲類副產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，試驗(yàn)中通過采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）中的選擇離子監(jiān)測(cè)模式測(cè)定反應(yīng)后半抗原與副產(chǎn)物的量，進(jìn)而判斷反應(yīng)能否順利進(jìn)行。測(cè)定結(jié)果表明，反應(yīng)結(jié)束后偶聯(lián)體系中的半抗原（[M+H]=231.0）的量顯著少于對(duì)照體系，同時(shí)偶聯(lián)體系中有大量副產(chǎn)物（[M+H]=1742）產(chǎn)生，說明半抗原分子與固相載體偶聯(lián)成功，經(jīng)計(jì)算偶聯(lián)效率約為60%。偶聯(lián)小分子化合物至固相載體的過程在合成化學(xué)中相對(duì)比較成熟，有研究認(rèn)為，在應(yīng)用此類反應(yīng)時(shí)往往只是直接反應(yīng)，而對(duì)反應(yīng)是否發(fā)生不進(jìn)行監(jiān)控[18]。本研究所采用的鑒定方法較簡單有效，可為相關(guān)學(xué)者提供參考。

2.2甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥廣譜特異性抗體的親和純化

將上述連接產(chǎn)物裝填成1 mL 的親和柱，用于甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥廣譜特異性抗體的純化。收集純化過程中各步驟樣品分別采用不連續(xù)體系的非變性SDS-PAGE 電泳和直接非競(jìng)爭ELISA 進(jìn)行純度和活性鑒定。SDS-PAGE 電泳結(jié)果表明，廣譜特異性抗體純化效果良好（圖2-a），并對(duì)樣品純化前后的體積和蛋白濃度進(jìn)行計(jì)算，得到純化產(chǎn)率約為78.5%。將各部分樣品的蛋白濃度調(diào)為一致進(jìn)行直接非競(jìng)爭ELISA，結(jié)果顯示，純化后抗體的D450 nm略高于純化前的樣品，而純化洗滌液的D450 nm較小（圖2-b）。說明親和純化過程能夠?qū)⒁恍┑陀H和力的抗體去除，而高親和力的抗體能夠保留下來。抗體純化效果主要受洗滌液的類型、體積和流速等條件影響，本研究采用典型的洗滌條件進(jìn)行抗體純化，獲得了較好的純化效果。

2.3抗體純化前后的特異性和親和力

筆者所在的課題組前期研究結(jié)果表明，所用廣譜特異性抗體能夠識(shí)別馬拉硫磷、樂果、稻豐散、亞胺硫磷、殺撲磷等一系列甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥。因此，本試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定了純化后的抗體對(duì)上述農(nóng)藥的識(shí)別活性，并與純化前進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示。純化后，廣譜特異性抗體對(duì)樂果的交叉反應(yīng)率略變大，而對(duì)稻豐散、亞胺硫磷和殺撲磷的交叉反應(yīng)率有所減小。可能因?yàn)樵诩兓^程中去除的低親和力抗體主要是特異識(shí)別這3種對(duì)象的。但總體而言，經(jīng)過純化后的抗體依然能夠識(shí)別上述5種甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥，并且其IC50比純化前更低。這說明純化后的抗體對(duì)這些農(nóng)藥的親和力有所增強(qiáng)，能夠建立起更靈敏的檢測(cè)方法。

3結(jié)論

本研究成功地將甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥通用半抗原偶聯(lián)至固相載體中制備成親和純化柱，并應(yīng)用其對(duì)甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥抗血清進(jìn)行了親和純化。經(jīng)鑒定，親和純化效果良好，純化產(chǎn)率約為78.5%；純化后抗體的親和活性有所增強(qiáng)，而其對(duì)馬拉硫磷、樂果、稻豐散、亞胺硫磷、殺撲磷等農(nóng)藥對(duì)象的交叉反應(yīng)性未受影響。

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