出芝溫度對靈芝基質物質含量和酶活的影響*

魏 巍，余夢瑤，許曉燕，韓嘉鈺，3，江 南，鄭林用， 李文濤，3，羅 霞**

(1.四川省中醫藥科學院中藥細胞與分子生物學實驗室，四川 成都 610041; 2.四川省農業科學院，四川 成都 610066; 3.四川大學生命科學學院，四川 成都 610064)

出芝溫度對靈芝基質物質含量和酶活的影響*

魏 巍1，余夢瑤1，許曉燕1，韓嘉鈺1，3，江 南1，鄭林用2， 李文濤1，3，羅 霞1**

(1.四川省中醫藥科學院中藥細胞與分子生物學實驗室，四川 成都 610041; 2.四川省農業科學院，四川 成都 610066; 3.四川大學生命科學學院，四川 成都 610064)

研究了25℃、30℃和35℃三個出芝溫度條件下，利用人工氣候箱袋式栽培靈芝，其基質不同時期-部位的物質含量(總糖、還原糖、水溶性蛋白和游離氨基酸)與木質素酶系酶(漆酶和錳過氧化物酶)、纖維素酶系酶(羧甲基纖維素酶和濾紙酶)和酸性蛋白酶活性變化規律。結果顯示，在25℃時，靈芝能夠正常出芝，溫度高于30℃以后子實體分化受到抑制；且在25℃條件下，不同時期-部位基質中總糖和可溶性蛋白含量低于其它2個溫度處理組，而還原糖和游離氨基酸含量高于其它2個溫度處理組；同時，不同時期-部位基質中木質素酶系和纖維素酶系酶活力低于其它2個溫度處理組，但酸性蛋白酶活力高于另外其它2個溫度處理組。提示袋料靈芝栽培時出芝溫度控制在25℃左右利于其子實體生長發育。

靈芝；袋料；溫度；出芝；酶活

靈芝(Ganodermalucidum)作為1種在民間及臨床應用廣泛且具有極高藥用價值的名貴藥用真菌，被《中華人民共和國藥典》(2010年版)與《美國草藥藥典與治療概要》收錄，其現代研究、開發與應用已受到國內外諸多學者的重視[1]。

溫度作為靈芝生長發育過程中相當重要的環境因素，目前研究僅限于其對菌絲生長速度、子實體產量等農藝指標的影響[2-4]，尚未見出芝溫度對靈芝營養代謝影響的深入研究報道。

在現有食(藥)用菌營養代謝變化規律的研究中，往往將基質內菌絲體或子實體視為1個整體，僅按照不同時間進行取樣分析[5]，而忽視了菌絲體和子實體不同部位因生長時間的不同、發育階段的不同而導致的分化，使得研究結果存在一定的局限性。

本論文采用時空模式的研究思路，研究了出芝溫度對靈芝不同時期-部位基質的物質含量和酶活力的影響，為深入探究靈芝袋料栽培過程中最適出芝溫度條件及其機理奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

靈芝ZL13，由四川省中醫藥科學院細胞與分子生物學實驗室提供。

1.2 實驗材料及試劑

木屑、棉籽殼、玉米芯、麥麩、石灰和石膏購自農資市場，ABTS和木聚糖購自Sigma公司，其余試劑均為國產分析純。

1.3 供試培養基

1.3.1 母種培養基配制

土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH自然。

1.3.2 原種培養基配制

玉米粒99%、石膏1%，pH自然，含水量60%左右。

1.3.3 栽培培養基配制

木屑15%、棉籽殼60%、玉米芯15%、麥麩8%、石灰1%、石膏1%，pH5～6，含水量60%左右。將木屑、麥麩、玉米芯、石灰和石膏混合均勻，摻入預濕24 h的玉米芯中拌勻。選用23 cm×42 cm×0.03 cm的聚乙烯袋，每袋裝濕料 2 000 g，121℃高壓滅菌2.5 h，冷卻至室溫后每袋接入玉米粒原種10粒。

1.4 培養條件及栽培方法

菌絲生長階段的培養條件為25℃，避光，濕度50%～60%；出芝階段培養條件為光照300 lx，濕度90%，溫度處理分25℃、30℃和35℃進行。所有催蕾及出芝均在人工氣候箱內進行。

1.5 采樣方法及粗酶液制備

把靈芝生殖生長期分為5個階段：菌絲滿袋(時期1)、原基期(時期2：靈芝剛長出白色球狀子實體)、菌蕾期(時期3：白色球狀子實體開始分化，有突起產生)、開片期(時期4：靈芝為腎形，有淡黃色邊緣)、子實體成熟期(時期5：彈射孢子)。將培養料均分為4部分，分別標記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，具體采樣方法如表1所示。

表1 取樣表

準確稱取同時期同一待測樣品2份，每份5 g，將其中1份稱好的樣品放入50 mL三角瓶中，加蒸餾水25 mL，在40 ℃恒溫水浴鍋內浸提2 h，3層紗布過濾，10 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液，用于測定酶活；另外1份在80℃恒溫干燥箱內烘至恒重，用于確定基質干重。設置3個重復。

1.6 基質中物質含量的測定

采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定總糖[6]和還原糖的含量；采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量；采用茚三酮顯色法測定游離氨基酸含量。

1.7 基質中胞外酶活性的測定

漆酶活力采用ABTS法測定[7]；錳過氧化物酶活力采用Mn(Ⅱ)氧化法測定[7]；纖維素酶和濾紙酶活力采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定[8]；酸性蛋白酶活性采用福林-酚試劑法測定[9]。

漆酶活力單位定義為每分鐘催化1 μmolABTS氧化所需要的酶量；錳過氧化物酶活力單位定義為每分鐘使吸光度值增加0.1的酶量；纖維素酶和濾紙酶活力單位定義為每分鐘催化生成1 mg葡萄糖所需要的酶量；酸性蛋白酶活力單位定義為每克干料1 min內水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量。

2 結果與分析

2.1 不同出芝溫度對靈芝子實體生長發育的影響

在本研究中，靈芝生殖生長期均在人工氣候箱內進行，以便能夠精準地控制靈芝出芝溫度。靈芝菌絲滿袋后，將菌袋移入3個溫度分別設定為25℃、30℃和35℃的人工氣候箱內(無晝夜溫差)。研究結果表明，在25℃培養條件下，靈芝能夠正常出芝；當溫度為30℃時，靈芝能出原基，但是由于培養溫度稍高，靈芝原基很快干縮，不能正常分化開片；在35℃時，靈芝則不能出原基。

2.2 不同時期-部位基質中總糖和還原糖含量的變化規律

不同出芝溫度下，靈芝生殖生長期內不同時期和部位基質中總糖和還原糖含量變化規律如圖1所示。在不同培養溫度下，不同部位基質中總糖含量差異不大。當出芝溫度為25℃和30℃時，部位-Ⅰ、部位-Ⅱ和部位-Ⅳ基質中總糖含量變化規律相同，即先升高后下降，然而部位-Ⅲ中總糖含量變化趨勢卻與其他部位相反。在35℃培養條件下，不同部位基質中總糖含量一直呈升高趨勢。

圖1結果顯示，溫度對基質中還原糖含量的影響較大，在25℃培養條件下，各部位基質中還原糖含量始終高于30℃和35℃處理組。在靈芝的生殖生長期內，30℃和35℃對基質中還原糖含量的影響基本相同，即還原糖含量都維持在較低水平，無較大波動。

2.3 不同時期-部位基質中可溶性蛋白質和游離氨基酸含量的變化規律

基質中可溶性蛋白質和游離氨基酸含量在不同出芝溫度下各時期及各部位的變化規律如圖2所示。

從圖2可以看出，可溶性蛋白質含量總體呈現下降趨勢，并且當培養溫度為25℃時，不同部位基質中可溶性蛋白質含量始終低于另外2個處理組。溫度對基質各部位中游離氨基酸含量變化趨勢影響不明顯，在不同溫度處理下，游離氨基酸含量從滿袋期至原基時期呈升高趨勢，其含量均在原基期出現1個峰值然后略有下降。由圖2可知，25℃時，不同時期和部位基質中游離氨基酸含量總體高于其他2個溫度處理。

2.4 不同時期-部位基質中木質素酶系酶活的變化規律

2.4.1 不同溫度對漆酶活性變化規律的影響

靈芝生殖生長階段溫度對不同時期和部位基質中漆酶活性變化規律如圖3所示。

總體來看，生殖生長階段漆酶活性先經歷1個上升階段最終呈下降趨勢，溫度對漆酶活性峰值出現的時期有一定影響。25℃時，基質部位-Ⅰ的漆酶酶活原基期出現1個高峰，隨后急劇下降，并穩定在較低水平；30℃時，漆酶活性總體處于較高水平，部位-Ⅰ處漆酶酶活在開片期(時期4)達到最高；35℃時，漆酶活性的峰值則出現在菌蕾期。

2.4.2 不同溫度對錳過氧化物酶活性變化規律的影響

不同溫度對錳過氧化物酶活性變化規律的影響情況見圖4。

從圖4可以看出，錳過氧化物酶活性變化趨勢與漆酶活性變化趨勢類似，溫度對其影響也基本相同，但部位-Ⅰ、部位-Ⅱ在30℃時的峰值提前到原基時期(時期1)，而當溫度為25℃和35℃時，錳過氧化物酶活力在菌蕾期(時期3)和開片期(時期4)出現峰值。當培養溫度為25℃時，各部位基質中錳過氧化物酶活力略低于另外2個實驗組。

2.5 不同時期-部位基質中纖維素酶系酶活變化規律

2.5.1 不同溫度對羧甲基纖維素酶活性變化規律的影響

不同溫度對羧甲基纖維素酶活性變化規律的影響見圖5。

從圖5可以看出，隨著靈芝的生長發育，靈芝生殖生長階段基質內羧甲基纖維素酶活性總體呈上升趨勢。溫度對不同時期和部位基質中羧甲基纖維素酶活力的影響較大，25℃時基質-Ⅰ內的羧甲基纖維素酶活性較低，變化趨勢平穩且始終低于30℃和35℃處理組。

2.5.2 不同溫度對濾紙酶活性變化規律的影響

溫度對靈芝生殖生長階段不同時期和部位基質中濾紙酶活性變化的影響與對羧甲基纖維素酶活性影響相似，結果見圖6。

從圖6可以看出，25℃時濾紙酶活性在原基期(時期2)最低，然后有所升高，但總體活性水平仍低于其余2個溫度實驗組。在30℃和35℃條件下，不同時期和部位基質中靈芝濾紙酶活力波動較大，且活力較高。

2.6 不同時期-部位基質中酸性蛋白酶活性的變化規律

靈芝生殖生長階段內，溫度對不同時期和部位基質中酸性蛋白酶活性變化規律的影響如圖7所示。

從圖7可以看出，25℃時，酸性蛋白酶活力總體呈現先升高后下降再升高的趨勢，其中部位-Ⅰ、部位-Ⅱ、部位-Ⅲ在菌蕾期(時期3)活性有峰值，而部位-Ⅳ酶活的峰值出現在原基期，各部位在成熟期(時期5)酸性蛋白酶活性有所升高。30℃、35℃時，酸性蛋白酶活性在原基期(時期2)降至最低后基本維持不變。結果顯示，出芝溫度為25℃時，靈芝酸性蛋白酶活力較高，而其它2個實驗組中酸性蛋白酶活力則較低，并且始終低于25℃處理組。

3 討論

食(藥)用菌在菌絲生長階段，通過分解基質內的木質素和纖維素等，合成、儲存子實體發育所需的能量物質[10]，進入生殖生長時期后通過分解儲存的能量物質供應子實體的發育。本研究發現，出芝溫度在25℃時，靈芝可正常出芝；30℃時，僅分化原基；35℃時完全不出芝。推測在25℃時由于靈芝能正常出芝，故需要將基質中儲存的能量物質分解以供應其子實體生長，因而其基質的不同時期-部位的還原糖含量均高于30℃和35℃處理組，而總糖含量則低于30℃和35℃處理組。

在本研究中，不同溫度條件下，靈芝生殖生長階段不同時期-部位的基質中木質素酶系的漆酶和錳過氧化物酶整體均呈現小幅下降的趨勢，這可能是由于大量木質素在菌絲生長階段已經被降解，生殖生長階段靈芝菌絲很少再分泌該類酶，因此溫度對其影響不大。由于植物組織中木質素與纖維素以共價鍵形式緊密結合，并將纖維素分子包埋在其中，木質素降解后再開始降解纖維素，因此纖維素酶系的羧甲基纖維素酶和濾紙酶在生殖生長階段活性會開始增加[8，11]。本研究也發現，溫度對靈芝生殖生長階段不同時期-部位基質中纖維素酶系的酶活力影響顯著，而且隨著溫度升高其酶活力增加，較高的溫度更利于纖維素酶的分泌。

真菌菌絲體中富含蛋白酶，蛋白酶在菌絲體生長過程中參與蛋白質的水解，為菌絲體提供氮源類物質[12]。靈芝轉入生殖生長期之后，基質中的蛋白酶活力逐漸升高，用于滿足靈芝子實體發育對氮源的需求，因此在靈芝生殖生長階段，其基質中可溶性蛋白含量下降，而游離氨基酸含量逐漸上升。到了子實體發育后期，由于靈芝對CN需求的變化，靈芝胞外蛋白酶活力迅速下降并維持在較低水平。溫度對蛋白酶活力影響較大，當出芝溫度25℃時，靈芝基質的不同部位-時期的蛋白酶活力均高于30℃和35℃處理組，提示蛋白酶活力與子實體正常發育密切相關。

綜上所述，溫度對靈芝子實體形成具有顯著的影響，在高于30℃的恒定溫度條件下靈芝很難分化子實體，其作用機制還有待進一步深入研究。在實際生產中，靈芝大棚溫度需注意保持在25℃左右，避免長期高于30℃，否則會嚴重影響靈芝的正常生長。

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Effects of Temperatures on the Substance Content and Extracellular Enzyme Activity of Culture Substrate DuringGanodermalucidumReproductive Stage

WEI Wei1, YU Meng-yao1, XU Xiao-yan1, HAN Jia-yu1,3, JIANG Nan1, ZHENG Lin-yong2, LI Wen-tao1,3, LUO Xia1

(1.Sichuan Academy of Chinese Medicine Science, SichuanChengdu610041; 2.Sichuan Academy of Agricultural Sciences, SichuanChengdu610066; 3.College of Life Sciences, Sichuan University, SichuanChengdu610064)

Under 25℃, 30℃ and 35℃ conditions, the changes of substance content (total sugar, reducing sugar, water soluble protein and free amino acid), lignin enzymes (laccase and manganese peroxidase), cellulose enzymes (carboxymethyl cellulase and filter paper enzyme), acid protease activity of bag culture substrate were studied duringGanodermalucidumreproductive stage in different periods of different parts. The results showed thatG.lucidumfruiting body could form at 25℃, and the formation was inhibited above 30℃. DuringG.lucidumreproductive stage, in different periods of different parts, the substrate total sugar and water soluble protein was lower at 25℃ than it at 30℃ and 35℃, and the reducing sugar and free amino acid contents was higher at 25℃ than it at the other two temperatures. The lignin enzymes and cellulase enzymes activity in the culture substrate at 25℃ was lower than it at the other two temperatures, and acid protease activity at 25℃ was higher than it at the other two temperatures. It provided that it was helpful for bag culturedG.lucidumfruiting body formation at about 25℃.

Ganodermalucidum; Bag culture; Temperature; Reproductive stage; Enzymes activities

*項目來源：國家農業產業技術體系藥用菌栽培崗位建設項目，項目編號：農科教發[2007]12號；菌類藥材研究與開發四川省科技創新團隊，項目編號：2011JTD0021；四川省十二五育種攻關項目“菌類藥材優質種質資源的收集及新材料的選育”，項目編號：2011NZ0098-12-04；四川省公益性科研院所基本科研項目“袋料靈芝營養代謝-藥效成分時空關聯模式的研究”，項目編號：A-2014N-6。

魏巍(1982-)，男，助理研究員，主要從事食(藥)用菌的研究與開發。

**通信作者：羅霞，E-mail：lx1443_cn@sina.com

2014-09-30

S646.9

A

1003-8310(2014)06-0049-07