一株溶藻細菌的分離鑒定及溶藻特性研究

鐘鴻干+李培+孫楊

DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.02.001

摘 要：從三亞市大東海分離出1株有較強溶藻活性的細菌，命名為L-D1，并對該菌株進行形態和生理生化鑒定。L-D1的菌懸液對中肋骨條藻的生長有很強的抑制作用。試驗發現，L-D1是通過直接和間接的方式共同作用影響中肋骨條藻的生長的；L-D1的溶藻效果在溫度為25 ℃時優于其他溫度，鹽度為20‰時優于其他鹽度，全黑暗條件下的溶藻效果優于其他光照條件下的。

關鍵詞：溶藻細菌；中肋骨條藻；溶藻；赤潮

隨著水體富營養化的不斷加劇，海洋開發活動的日益增加，世界航運的不斷發達，以及沿海工業、農業、海洋養殖業以及旅游業的快速發展，導致赤潮發生的頻率增高、范圍擴大，已經成為一種全球性的海洋災害[1]。引發赤潮的生物有很多種，其中海洋浮游微藻是引發赤潮的主要生物。在四千多種海洋浮游微藻中有260多種能形成赤潮，其中有70種產生毒素[2]。溶藻細菌可以通過直接或間接的方式，抑制藻類生長或殺死藻類，而且具有經濟、安全、特異、特效、維持水體生態平衡等特點[3]。本研究通過對固體平板溶藻方法的改良，從三亞大東海分離出一株對中肋骨條藻具有溶藻效果的細菌，命名為L-D1，同時針對L-D1溶藻的特性，溶藻的方式以及環境因子對其溶藻效果的影響進行研究。

1 材料

1.1 藻種來源及培養

研究所用中肋骨條藻（Skeletonema costatum）為本實驗室分離保存。藻種經活化后，在25 ℃，光照強度為3 000 lx及光暗比為12 h∶12 h條件下培養。

液體培養基配方[4]如下：NaNO3 75 mg，NaH2PO4?H2O 5 mg，Na2SiO3?9H2O 20 mg，Na2EDTA 4.36 mg，FeCl3?6H2O 3.16 mg，CuSO4?5H2O 0.01 mg，ZnSO4?7H2O 0.023 mg，CoCl2?6H2O 0.012 mg，MnCl2?4H2O 0.18 mg，Na2MoO4?2H2O 0.07 mg，維生素B1 0.1 mg，維生素B12 0.5 mg，生物素 0.5 mg，陳海水 1 L。

固體培養配方如下：1 000 mL 上述液體培養基中加入10～15 g瓊脂。

1.2 細菌培養基

細菌固體培養基：蛋白胨10 g，肉浸粉 3 g，NaCl 5 g，瓊脂 15 g，1 000 mL 蒸餾水。

細菌液體培養基：蛋白胨 10 g，牛肉粉 3 g，NaCl 5 g，1 000 mL 蒸餾水。

1.3 樣品采集

2012年于海南省三亞市大東海采集海水用于溶藻細菌的分離。所采集樣品在低溫下保存并在4 h內送回實驗室進行分離。

2 方法

2.1 溶藻細菌的分離

將采集的海水水樣用無菌陳海水進行梯度稀釋后，采用涂布法獲得細菌單菌落。然后進行溶藻細菌的篩選，把冷卻至45 ℃以下含有中肋骨條藻的固體培養基快速搖勻倒平板，待培養基凝固后，用無菌打孔器將從海水中分離得到的細菌單菌落打下，并倒置在中肋骨條藻平板上，在26 ℃，光照強度為3 000 lx下培養，以無菌的營養瓊脂塊作為對照，每天觀察細菌單菌落周圍是否出現抑藻圈。

將產生抑藻圈的瓊脂塊取下，采用平板劃線法進行該菌的純化，并觀察記錄菌落形態特征。將純化的菌株接種于試管斜面培養基上，培養48 h后置4 ℃冰箱保存備用。

2.2 溶藻細菌的鑒定

對分離出的菌株進行革蘭氏染色、氧化酶，接觸酶，葡萄糖、甘露醇發酵，硝酸鹽還原，MR-VP，7.5% NaCl培養液等生理生化鑒定，其方法參照文獻[5]。

2.3 溶藻細菌在液體培養基中的溶藻效果

在液體培養基中將L-D1培養48 h后，加入到藻液中，進行液體溶藻試驗。按照1∶9的比例將菌液加入到中肋骨條藻藻液中，連續7 d觀察藻液變化情況。

2.4 溶藻細菌溶藻方式的探討

按照1∶9的比例在中肋骨條藻藻液中加入以下細菌培養物：細菌原液、高溫高壓處理后的菌液、高速離心沉降后的菌液、0.22 μm膜過濾后的菌液，同時設對照組。7 d后，分別測試它們對中肋骨條藻葉綠素a含量的影響。

2.5 環境因子對其溶藻效果的影響

光照是藻類生長繁殖的重要生態因子，本研究選擇了全黑暗、光循環、全光照三個光照條件，以探討光照對L-D1溶藻效果的影響。每天定時取樣，以葉綠素a含量變化為檢測指標。

溫度是影響生物體生長的重要環境因子，本實驗設置15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃，5個溫度梯度進行溶藻實驗，以研究溫度對溶藻細菌L-D1的影響。

鹽度是水生生物生存的限制因子，本研究分別以鹽度為15‰、20‰、25‰、30‰、35‰，5種不同鹽度的培養液進行細菌溶藻實驗。

3 結果與分析

3.1 溶藻細菌的篩選

在中肋骨條藻平板中（如圖1），帶有細菌菌落的瓊脂塊（b）周圍出現了直徑約為20 mm的抑藻圈，而對照瓊脂塊（a）周圍的藻生長正常。

3.2 溶藻細菌生理生化鑒定結果

菌株L-D1為革蘭氏陽性菌，菌落呈圓形、乳白色半透明、表面光滑，在液體培養基里呈直桿狀，具芽孢，可運動帶鞭毛。氧化酶陰性，接觸酶陽性，發酵葡萄糖只產酸不產氣，可利用甘露醇產酸，可還原硝酸鹽，MR陽性，VP陰性，在7.5%的NaCl中不能生長。

a為無菌瓊脂塊作對照，b為帶菌落的瓊脂塊產生的抑藻圈

圖1 溶藻細菌在固體培養基中對中肋骨

條藻的溶藻效果

3.3 溶藻細菌在液體培養基中對中肋骨條藻生長的影響

培養7 d后，與對照組相比，加入溶藻細菌的中肋骨條藻藻液出現大量土黃色絮凝狀沉淀（如圖2），顯微鏡觀察大量藻細胞凝聚集成團狀，且藻細胞周圍聚集了大量的細菌，只有極少數的藻細胞單個獨立存在。因此，溶藻細菌在液體培養基中也能抑制中肋骨條藻的生長。

圖2 添加菌懸液7d后，中肋骨條藻液照片

3.4 溶藻細菌的溶藻方式

溶藻細菌菌液經高溫處理、高速離心沉降、0.22 μm濾膜過濾后，加入到中肋骨條藻的藻液中進行共同培養，均可顯著抑制其葉綠素a的含量（P＜0.05），其中細菌原液對中肋骨條藻葉綠素a的合成抑制作用最強，其葉綠素a含量比對照組減少了73.80% ，表明菌株L-D1對中肋骨條藻葉綠素a含量的影響是通過直接和間接方式共同作用的。經高溫處理后的菌液對葉綠素a的含量仍有較強的抑制作用，表明菌株L-D1分泌的代謝物為非蛋白類物質，如圖3所示。

D1菌原液組，D2高溫滅菌組，D3離心沉降組，D4濾膜過濾組

圖3 經不同方式處理后的菌液對中肋骨條

藻葉綠素a含量的影響

3.5 環境因子對其溶藻效果的影響

3.5.1 光照對細菌溶藻效果的影響 三個光照條件下，菌株L-D1對中肋骨條藻葉綠素a的含量影響顯著（P＜0.05）。6 d后，全黑暗條件下藻的葉綠素a含量最少，為0.019 mg/L，與其相應的對照組比減少了67.74%；全光照條件下藻的葉綠素a含量最多，為0.064 mg/L。如圖4所示，Duncan多重比較結果表明，全黑暗條件下溶藻細菌對中肋骨條藻生長的抑制效果最好。

圖4 6 d后，不同光照條件下溶藻細菌對中肋骨

條藻葉綠素a含量的影響

3.5.2 溫度對細菌溶藻效果的影響 不同溫度條件下，菌株L-D1對中肋骨條藻葉綠素a的含量影響顯著（P＜0.05）。25 ℃時中肋骨條藻葉綠素a的含量為0.049 mg/L，與30、35 ℃時相比葉綠素a的含量分別減少了75.62%、85.92%。如圖5所示，通過Duncan多重比較，表明溶藻細菌在25 ℃下對中肋骨條藻生長的抑制效果最好。

圖5 6 d后，不同溫度條件下溶藻細菌對中肋骨條

藻葉綠素a含量的影響

3.5.3 鹽度對細菌溶藻效果的影響 不同鹽度條件下，菌株L-D1對中肋骨條藻葉綠素a的含量影響顯著（P＜0.05）。鹽度為20‰時中肋骨條藻葉綠素a的含量為0.119 mg/L，與鹽度為15‰、30‰、35‰時相比葉綠素a的含量分別減少了24.7%、30.41%、36.02%。如圖6所示，溶藻細菌在鹽度為20‰時對中肋骨條藻生長的抑制效果最好。

圖6 6 d后，不同鹽度條件下溶藻細菌對中肋骨條

藻葉綠素a含量的影響

4 討論

作為防治赤潮的一種可能性生物，溶藻細菌的研究不但具有重要的理論價值還具有潛在的應用價值。國內外對于溶藻細菌的分離有多種途徑，裴海燕等[6] 利用海綿固定化微生物系統分離出了對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）、小球藻（Chlorella sp.）及柵藻（Scenedesmus sp.）具有較強溶解效果的細菌菌株。曹賓霞等[7]用試管法篩選對塔瑪亞歷山大藻具有溶藻能力的細菌。這兩種方法的工作量都較大。王海玉等[8]分離出一株紅色溶藻細菌對銅綠微囊藻有很強的溶解效果，該方法采用了果膠分解菌的培養基，所以對溶藻細菌的生存環境具有一定限制，在實際應用中存在局限。本實驗通過對固體平板溶藻法的改良，首先通過涂布法獲得不同細菌的單菌落，然后利用這些單菌落進行固體培養基溶藻試驗，選擇產生抑藻圈的菌株進行液體培養基溶藻試驗，進一步驗證其溶藻的效果。該方法分離周期短且操作簡單，是一種分離篩選溶藻細菌的有效途徑。

溶藻細菌主要通過以下方式實現溶藻效果：一是與藻細胞競爭營養物質；二是分泌胞外物質如蛋白質、抗生素等作用于藻細胞，導致藻細胞死亡；三是寄生于藻細胞內進行增殖，從而使得藻細胞裂解死亡[9]。在以往的研究中，大部分分離篩選得到的溶藻細菌屬于間接性溶藻，只有少部分屬于直接性溶藻[10]。為了探討菌株L-D1對中肋骨條藻的溶解方式，將不同方式處理的菌懸液按照一定比例加入到中肋骨條藻液體培養基中，均能抑制藻細胞的生長，其中菌原液對藻細胞的抑制作用最強，經濾膜過濾的菌液和經離心沉降的菌液對藻細胞有一定的抑制作用，而經高溫處理后的菌液仍有較強的溶藻活性，說明細菌分泌物具有很強的溶藻效果，且熱穩定性較高。結果表明菌株L-D1的作用方式以間接溶藻為主，同時進行直接溶藻。

光照主要通過光合作用影響藻細胞的生長，而對細菌的影響不大。很多研究表明在無光照的條件下，藻細胞的光合作用幾乎無法進行，此時藻細胞很容易受到溶藻細菌的攻擊而死亡[11]。本研究得出的結論與其它研究一致，即全黑條件下菌株L-D1對中肋骨條藻生長的抑制效果最強。在光循環條件、全光條件下菌株L-D1的溶藻效果依次減弱。在全黑暗條件下，中肋骨條藻的光合作用無法進行，而菌株L-D1的增殖卻不受影響。隨著培養時間的增加，溶藻細菌的數量逐漸超過藻細胞的數量呈現出較強的溶藻效果。而在全光照條件下，中肋骨條藻由于光適應周期較長，所以藻細胞可以持續生長。其增長速度不斷提高，而細菌增長速度基本不變，所以藻細胞數量呈現增長趨勢。

如果某一溫度有利于溶藻細菌的生長，而對藻細胞的生長影響很小或者具有一定抑制作用，那么將呈現出明顯的溶菌效果，反之，呈現出弱的溶藻效果或無溶藻效果[12]。由于中肋骨條藻為廣溫的典型代表，其在溫度較高時仍能保持很高的生長率。溫度在30～35 ℃時藻細胞的生長率超過菌株L-D1的，呈現出較弱的溶藻效果；而溫度在20～25 ℃時菌株L-D1的生長率超過藻細胞的，則呈現出較強的溶藻效果。

微藻和細菌都有最適生長鹽度，當低于或高于該鹽度時，對其生長都會產生影響[13]。中肋骨條藻作為廣鹽的典型代表，鹽度的變化對其生長的影響并不明顯，而對菌株L-D1的影響則比較大。在鹽度為20‰～25‰時，其比較適宜菌株L-D1的生長，故溶藻效果比較明顯。而鹽度為15‰、35‰時，其不適宜菌株L-D1的生長，故溶藻效果較弱。

參考文獻：

[1] 彭超，吳剛，席宇，等.3株溶藻細菌的分離鑒定及其溶藻效應[J].環境科學研究；2003（01）：37-40+56

[2]Zhou M J，Zhu M Y and Zhang J.Status of harmful algal blooms and related research activities in China[J].Chinese Bulletin of Life Science，2001，13(2):54-59

[3] 吳剛，席宇，趙以軍.溶藻細菌研究的最新進展[J].環境科學研究，2002，15(5):43-46

[4] Rippka R J，Deruelles J，Waterbury M，et al.Generic assignments，strain histories and properties of pure culttures of cyanobacteria[J].J.Gen.Microbiol，1979，111:1-61

[5]中國科學院微生物研究所細菌分類組.一般細菌常用鑒定方法[M].北京：科學出版社，1978

[6] 裴海燕，胡文容，曲音波，等.一株溶藻細菌的分離鑒定及其溶藻特性[J].環境科學學報，2005，25(6): 796-802

[7] 曹賓霞，王耀兵，趙水晶，等.塔瑪亞歷山大藻溶藻細菌篩選方法的初步研究[J]，海洋環境科學，2008，27(2): 186-189

[8] 王海玉，趙芳，彭謙，等.溶藻細菌W-04的篩選及溶藻效果初探[J]，中國農學通報，2009，25(20): 267-271

[9] 李效字，宋立榮，劉永定.微囊藻毒素的產生、檢測和毒理學研究[J].水生生物學報，1999，23(5): 517 -522

[10] Skerratt J H，Bowman JP，Hallegraeff G，et al.Algicidal bacteria associated with blooms of a toxic dinoflagellate in a temperate Australian estuary[J].Mar Ecol Progser，2002，244: 1-15

[11] 史順玉，沈銀武，李敦海，等.溶藻細菌DC21的分離、鑒定及其溶藻特性[J].中國環境科學，2006，26(5):587-590

[12] 闞振榮，王欣伊，李彥芹，等.菌-藻、藻-藻間化感作用初探[J].微生物學雜志，2006，26(5): 14-18

[13] 易齊濤.海洋菌-藻關系及對營養鹽的吸收作用研究[D].青島:中國海洋大學碩士學位論文，2006Isolation ，Identification and Characterization of one algae-lysing bacteria

ZHONG Hong

--------------------------------------------------------------------------------

gan, LI Pei, SUN Yang

(Sanya Marine and fishery monitoring center,sanya hainan 572000 China)

Abstract：A strain of marine algae-lysing bacteria designated as L-D1 was isolated from Dadonghai in Sanya of China.According to the studies the strain L-D1 could effectively dissolve Skeletonema costatum and lysed algae by drect and inderect ways.The inhibitory effect of chlorophyll a of Skeletonema costatum was better than other grades when temperature was 25 ℃.And the optimal salinity of algae-lysing is 20.In the dark condition，L-D1 was more inhibited on the chlorophylla content of algae.

Key words： Algae-lysing bacteria；Skeletonema costatum；Lysis；red tide

（收稿日期：2013-11-01；修回日期：2013-11-14）

圖4 6 d后，不同光照條件下溶藻細菌對中肋骨

條藻葉綠素a含量的影響

3.5.2 溫度對細菌溶藻效果的影響 不同溫度條件下，菌株L-D1對中肋骨條藻葉綠素a的含量影響顯著（P＜0.05）。25 ℃時中肋骨條藻葉綠素a的含量為0.049 mg/L，與30、35 ℃時相比葉綠素a的含量分別減少了75.62%、85.92%。如圖5所示，通過Duncan多重比較，表明溶藻細菌在25 ℃下對中肋骨條藻生長的抑制效果最好。

圖5 6 d后，不同溫度條件下溶藻細菌對中肋骨條

藻葉綠素a含量的影響

3.5.3 鹽度對細菌溶藻效果的影響 不同鹽度條件下，菌株L-D1對中肋骨條藻葉綠素a的含量影響顯著（P＜0.05）。鹽度為20‰時中肋骨條藻葉綠素a的含量為0.119 mg/L，與鹽度為15‰、30‰、35‰時相比葉綠素a的含量分別減少了24.7%、30.41%、36.02%。如圖6所示，溶藻細菌在鹽度為20‰時對中肋骨條藻生長的抑制效果最好。

圖6 6 d后，不同鹽度條件下溶藻細菌對中肋骨條

藻葉綠素a含量的影響

4 討論

作為防治赤潮的一種可能性生物，溶藻細菌的研究不但具有重要的理論價值還具有潛在的應用價值。國內外對于溶藻細菌的分離有多種途徑，裴海燕等[6] 利用海綿固定化微生物系統分離出了對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）、小球藻（Chlorella sp.）及柵藻（Scenedesmus sp.）具有較強溶解效果的細菌菌株。曹賓霞等[7]用試管法篩選對塔瑪亞歷山大藻具有溶藻能力的細菌。這兩種方法的工作量都較大。王海玉等[8]分離出一株紅色溶藻細菌對銅綠微囊藻有很強的溶解效果，該方法采用了果膠分解菌的培養基，所以對溶藻細菌的生存環境具有一定限制，在實際應用中存在局限。本實驗通過對固體平板溶藻法的改良，首先通過涂布法獲得不同細菌的單菌落，然后利用這些單菌落進行固體培養基溶藻試驗，選擇產生抑藻圈的菌株進行液體培養基溶藻試驗，進一步驗證其溶藻的效果。該方法分離周期短且操作簡單，是一種分離篩選溶藻細菌的有效途徑。

溶藻細菌主要通過以下方式實現溶藻效果：一是與藻細胞競爭營養物質；二是分泌胞外物質如蛋白質、抗生素等作用于藻細胞，導致藻細胞死亡；三是寄生于藻細胞內進行增殖，從而使得藻細胞裂解死亡[9]。在以往的研究中，大部分分離篩選得到的溶藻細菌屬于間接性溶藻，只有少部分屬于直接性溶藻[10]。為了探討菌株L-D1對中肋骨條藻的溶解方式，將不同方式處理的菌懸液按照一定比例加入到中肋骨條藻液體培養基中，均能抑制藻細胞的生長，其中菌原液對藻細胞的抑制作用最強，經濾膜過濾的菌液和經離心沉降的菌液對藻細胞有一定的抑制作用，而經高溫處理后的菌液仍有較強的溶藻活性，說明細菌分泌物具有很強的溶藻效果，且熱穩定性較高。結果表明菌株L-D1的作用方式以間接溶藻為主，同時進行直接溶藻。

光照主要通過光合作用影響藻細胞的生長，而對細菌的影響不大。很多研究表明在無光照的條件下，藻細胞的光合作用幾乎無法進行，此時藻細胞很容易受到溶藻細菌的攻擊而死亡[11]。本研究得出的結論與其它研究一致，即全黑條件下菌株L-D1對中肋骨條藻生長的抑制效果最強。在光循環條件、全光條件下菌株L-D1的溶藻效果依次減弱。在全黑暗條件下，中肋骨條藻的光合作用無法進行，而菌株L-D1的增殖卻不受影響。隨著培養時間的增加，溶藻細菌的數量逐漸超過藻細胞的數量呈現出較強的溶藻效果。而在全光照條件下，中肋骨條藻由于光適應周期較長，所以藻細胞可以持續生長。其增長速度不斷提高，而細菌增長速度基本不變，所以藻細胞數量呈現增長趨勢。

如果某一溫度有利于溶藻細菌的生長，而對藻細胞的生長影響很小或者具有一定抑制作用，那么將呈現出明顯的溶菌效果，反之，呈現出弱的溶藻效果或無溶藻效果[12]。由于中肋骨條藻為廣溫的典型代表，其在溫度較高時仍能保持很高的生長率。溫度在30～35 ℃時藻細胞的生長率超過菌株L-D1的，呈現出較弱的溶藻效果；而溫度在20～25 ℃時菌株L-D1的生長率超過藻細胞的，則呈現出較強的溶藻效果。

微藻和細菌都有最適生長鹽度，當低于或高于該鹽度時，對其生長都會產生影響[13]。中肋骨條藻作為廣鹽的典型代表，鹽度的變化對其生長的影響并不明顯，而對菌株L-D1的影響則比較大。在鹽度為20‰～25‰時，其比較適宜菌株L-D1的生長，故溶藻效果比較明顯。而鹽度為15‰、35‰時，其不適宜菌株L-D1的生長，故溶藻效果較弱。

參考文獻：

[1] 彭超，吳剛，席宇，等.3株溶藻細菌的分離鑒定及其溶藻效應[J].環境科學研究；2003（01）：37-40+56

[2]Zhou M J，Zhu M Y and Zhang J.Status of harmful algal blooms and related research activities in China[J].Chinese Bulletin of Life Science，2001，13(2):54-59

[3] 吳剛，席宇，趙以軍.溶藻細菌研究的最新進展[J].環境科學研究，2002，15(5):43-46

[4] Rippka R J，Deruelles J，Waterbury M，et al.Generic assignments，strain histories and properties of pure culttures of cyanobacteria[J].J.Gen.Microbiol，1979，111:1-61

[5]中國科學院微生物研究所細菌分類組.一般細菌常用鑒定方法[M].北京：科學出版社，1978

[6] 裴海燕，胡文容，曲音波，等.一株溶藻細菌的分離鑒定及其溶藻特性[J].環境科學學報，2005，25(6): 796-802

[7] 曹賓霞，王耀兵，趙水晶，等.塔瑪亞歷山大藻溶藻細菌篩選方法的初步研究[J]，海洋環境科學，2008，27(2): 186-189

[8] 王海玉，趙芳，彭謙，等.溶藻細菌W-04的篩選及溶藻效果初探[J]，中國農學通報，2009，25(20): 267-271

[9] 李效字，宋立榮，劉永定.微囊藻毒素的產生、檢測和毒理學研究[J].水生生物學報，1999，23(5): 517 -522

[10] Skerratt J H，Bowman JP，Hallegraeff G，et al.Algicidal bacteria associated with blooms of a toxic dinoflagellate in a temperate Australian estuary[J].Mar Ecol Progser，2002，244: 1-15

[11] 史順玉，沈銀武，李敦海，等.溶藻細菌DC21的分離、鑒定及其溶藻特性[J].中國環境科學，2006，26(5):587-590

[12] 闞振榮，王欣伊，李彥芹，等.菌-藻、藻-藻間化感作用初探[J].微生物學雜志，2006，26(5): 14-18

[13] 易齊濤.海洋菌-藻關系及對營養鹽的吸收作用研究[D].青島:中國海洋大學碩士學位論文，2006Isolation ，Identification and Characterization of one algae-lysing bacteria

ZHONG Hong

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gan, LI Pei, SUN Yang

(Sanya Marine and fishery monitoring center,sanya hainan 572000 China)

Abstract：A strain of marine algae-lysing bacteria designated as L-D1 was isolated from Dadonghai in Sanya of China.According to the studies the strain L-D1 could effectively dissolve Skeletonema costatum and lysed algae by drect and inderect ways.The inhibitory effect of chlorophyll a of Skeletonema costatum was better than other grades when temperature was 25 ℃.And the optimal salinity of algae-lysing is 20.In the dark condition，L-D1 was more inhibited on the chlorophylla content of algae.

Key words： Algae-lysing bacteria；Skeletonema costatum；Lysis；red tide

（收稿日期：2013-11-01；修回日期：2013-11-14）

圖4 6 d后，不同光照條件下溶藻細菌對中肋骨

條藻葉綠素a含量的影響

3.5.2 溫度對細菌溶藻效果的影響 不同溫度條件下，菌株L-D1對中肋骨條藻葉綠素a的含量影響顯著（P＜0.05）。25 ℃時中肋骨條藻葉綠素a的含量為0.049 mg/L，與30、35 ℃時相比葉綠素a的含量分別減少了75.62%、85.92%。如圖5所示，通過Duncan多重比較，表明溶藻細菌在25 ℃下對中肋骨條藻生長的抑制效果最好。

圖5 6 d后，不同溫度條件下溶藻細菌對中肋骨條

藻葉綠素a含量的影響

3.5.3 鹽度對細菌溶藻效果的影響 不同鹽度條件下，菌株L-D1對中肋骨條藻葉綠素a的含量影響顯著（P＜0.05）。鹽度為20‰時中肋骨條藻葉綠素a的含量為0.119 mg/L，與鹽度為15‰、30‰、35‰時相比葉綠素a的含量分別減少了24.7%、30.41%、36.02%。如圖6所示，溶藻細菌在鹽度為20‰時對中肋骨條藻生長的抑制效果最好。

圖6 6 d后，不同鹽度條件下溶藻細菌對中肋骨條

藻葉綠素a含量的影響

4 討論

作為防治赤潮的一種可能性生物，溶藻細菌的研究不但具有重要的理論價值還具有潛在的應用價值。國內外對于溶藻細菌的分離有多種途徑，裴海燕等[6] 利用海綿固定化微生物系統分離出了對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）、小球藻（Chlorella sp.）及柵藻（Scenedesmus sp.）具有較強溶解效果的細菌菌株。曹賓霞等[7]用試管法篩選對塔瑪亞歷山大藻具有溶藻能力的細菌。這兩種方法的工作量都較大。王海玉等[8]分離出一株紅色溶藻細菌對銅綠微囊藻有很強的溶解效果，該方法采用了果膠分解菌的培養基，所以對溶藻細菌的生存環境具有一定限制，在實際應用中存在局限。本實驗通過對固體平板溶藻法的改良，首先通過涂布法獲得不同細菌的單菌落，然后利用這些單菌落進行固體培養基溶藻試驗，選擇產生抑藻圈的菌株進行液體培養基溶藻試驗，進一步驗證其溶藻的效果。該方法分離周期短且操作簡單，是一種分離篩選溶藻細菌的有效途徑。

溶藻細菌主要通過以下方式實現溶藻效果：一是與藻細胞競爭營養物質；二是分泌胞外物質如蛋白質、抗生素等作用于藻細胞，導致藻細胞死亡；三是寄生于藻細胞內進行增殖，從而使得藻細胞裂解死亡[9]。在以往的研究中，大部分分離篩選得到的溶藻細菌屬于間接性溶藻，只有少部分屬于直接性溶藻[10]。為了探討菌株L-D1對中肋骨條藻的溶解方式，將不同方式處理的菌懸液按照一定比例加入到中肋骨條藻液體培養基中，均能抑制藻細胞的生長，其中菌原液對藻細胞的抑制作用最強，經濾膜過濾的菌液和經離心沉降的菌液對藻細胞有一定的抑制作用，而經高溫處理后的菌液仍有較強的溶藻活性，說明細菌分泌物具有很強的溶藻效果，且熱穩定性較高。結果表明菌株L-D1的作用方式以間接溶藻為主，同時進行直接溶藻。

光照主要通過光合作用影響藻細胞的生長，而對細菌的影響不大。很多研究表明在無光照的條件下，藻細胞的光合作用幾乎無法進行，此時藻細胞很容易受到溶藻細菌的攻擊而死亡[11]。本研究得出的結論與其它研究一致，即全黑條件下菌株L-D1對中肋骨條藻生長的抑制效果最強。在光循環條件、全光條件下菌株L-D1的溶藻效果依次減弱。在全黑暗條件下，中肋骨條藻的光合作用無法進行，而菌株L-D1的增殖卻不受影響。隨著培養時間的增加，溶藻細菌的數量逐漸超過藻細胞的數量呈現出較強的溶藻效果。而在全光照條件下，中肋骨條藻由于光適應周期較長，所以藻細胞可以持續生長。其增長速度不斷提高，而細菌增長速度基本不變，所以藻細胞數量呈現增長趨勢。

如果某一溫度有利于溶藻細菌的生長，而對藻細胞的生長影響很小或者具有一定抑制作用，那么將呈現出明顯的溶菌效果，反之，呈現出弱的溶藻效果或無溶藻效果[12]。由于中肋骨條藻為廣溫的典型代表，其在溫度較高時仍能保持很高的生長率。溫度在30～35 ℃時藻細胞的生長率超過菌株L-D1的，呈現出較弱的溶藻效果；而溫度在20～25 ℃時菌株L-D1的生長率超過藻細胞的，則呈現出較強的溶藻效果。

微藻和細菌都有最適生長鹽度，當低于或高于該鹽度時，對其生長都會產生影響[13]。中肋骨條藻作為廣鹽的典型代表，鹽度的變化對其生長的影響并不明顯，而對菌株L-D1的影響則比較大。在鹽度為20‰～25‰時，其比較適宜菌株L-D1的生長，故溶藻效果比較明顯。而鹽度為15‰、35‰時，其不適宜菌株L-D1的生長，故溶藻效果較弱。

參考文獻：

[1] 彭超，吳剛，席宇，等.3株溶藻細菌的分離鑒定及其溶藻效應[J].環境科學研究；2003（01）：37-40+56

[2]Zhou M J，Zhu M Y and Zhang J.Status of harmful algal blooms and related research activities in China[J].Chinese Bulletin of Life Science，2001，13(2):54-59

[3] 吳剛，席宇，趙以軍.溶藻細菌研究的最新進展[J].環境科學研究，2002，15(5):43-46

[4] Rippka R J，Deruelles J，Waterbury M，et al.Generic assignments，strain histories and properties of pure culttures of cyanobacteria[J].J.Gen.Microbiol，1979，111:1-61

[5]中國科學院微生物研究所細菌分類組.一般細菌常用鑒定方法[M].北京：科學出版社，1978

[6] 裴海燕，胡文容，曲音波，等.一株溶藻細菌的分離鑒定及其溶藻特性[J].環境科學學報，2005，25(6): 796-802

[7] 曹賓霞，王耀兵，趙水晶，等.塔瑪亞歷山大藻溶藻細菌篩選方法的初步研究[J]，海洋環境科學，2008，27(2): 186-189

[8] 王海玉，趙芳，彭謙，等.溶藻細菌W-04的篩選及溶藻效果初探[J]，中國農學通報，2009，25(20): 267-271

[9] 李效字，宋立榮，劉永定.微囊藻毒素的產生、檢測和毒理學研究[J].水生生物學報，1999，23(5): 517 -522

[10] Skerratt J H，Bowman JP，Hallegraeff G，et al.Algicidal bacteria associated with blooms of a toxic dinoflagellate in a temperate Australian estuary[J].Mar Ecol Progser，2002，244: 1-15

[11] 史順玉，沈銀武，李敦海，等.溶藻細菌DC21的分離、鑒定及其溶藻特性[J].中國環境科學，2006，26(5):587-590

[12] 闞振榮，王欣伊，李彥芹，等.菌-藻、藻-藻間化感作用初探[J].微生物學雜志，2006，26(5): 14-18

[13] 易齊濤.海洋菌-藻關系及對營養鹽的吸收作用研究[D].青島:中國海洋大學碩士學位論文，2006Isolation ，Identification and Characterization of one algae-lysing bacteria

ZHONG Hong

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gan, LI Pei, SUN Yang

(Sanya Marine and fishery monitoring center,sanya hainan 572000 China)

Abstract：A strain of marine algae-lysing bacteria designated as L-D1 was isolated from Dadonghai in Sanya of China.According to the studies the strain L-D1 could effectively dissolve Skeletonema costatum and lysed algae by drect and inderect ways.The inhibitory effect of chlorophyll a of Skeletonema costatum was better than other grades when temperature was 25 ℃.And the optimal salinity of algae-lysing is 20.In the dark condition，L-D1 was more inhibited on the chlorophylla content of algae.

Key words： Algae-lysing bacteria；Skeletonema costatum；Lysis；red tide

（收稿日期：2013-11-01；修回日期：2013-11-14）