重組Lv—SWD蛋白的表達、純化與細菌結合試驗

杜志強　林濤

摘要：通過重組Lv-SWD蛋白的表達與純化，進行多克隆抗體的制備與細菌結合試驗，研究凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）重組SWD蛋白在先天免疫系統中的功能。結果表明，Lv-SWD的預測分子質量為12.9 ku，實際大小與理論值相符合。重組Lv-SWD蛋白作為抗原制備的多克隆抗體，可以較好地識別蛋白質本身，且可以直接結合巨大芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）以及弧菌（Vibrio）4種細菌。

關鍵詞：凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）；SWD抗菌肽；多克隆抗體制備；細菌結合試驗

中圖分類號：Q786 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-1189-02

目前，對于抗菌肽分子在先天免疫系統中發揮作用的機理還不是十分清楚，根據目前的研究結果來看，抗菌肽分子在發揮抑菌功能的過程中主要存在兩種模式，一種是直接與細菌作用將其瓦解，另一種是發揮蛋白酶活性抑制劑作用來將細菌除掉[1]。本研究以凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）重組Lv-SWD蛋白作為研究對象，通過蛋白質表達純化以及多克隆抗體的制備，利用細菌結合試驗來研究Lv-SWD的細菌結合作用，進一步豐富無脊椎動物先天免疫系統關于抗菌肽的基本理論。

1 材料與方法

1.1 材料

表達菌株是含有pET-28a-Lv-SWD重組子的大腸桿菌表達菌株。細菌結合試驗的目標菌株分別是2種革蘭氏陽性細菌（金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、巨大芽孢桿菌Bacillus subtilis）和2種革蘭氏陰性細菌（綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa和弧菌Vibrio）。制備多克隆抗體需要的家兔為包頭市花苑小動物市場購買的普通長耳白兔。

1.2 方法

1.2.1 目的蛋白的表達純化 對構建的重組Lv-SWD蛋白的重組表達菌株進行IPTG誘導表達，離心收集菌體進行超聲波破碎，并且通過蛋白質電泳試驗分析破碎后的上清液與包涵體沉淀中目的蛋白質的存在情況。對于存在于破碎后上清液中的目的蛋白質，可以直接利用His-tag鎳柱進行親和純化；對于存在于包涵體中的目的蛋白質，要進行變性后的透析處理，才能進行親和純化[2]。

1.2.2 多克隆抗體的制備與檢測 將親和純化后的目的重組蛋白質進行SDS-PAGE試驗，檢測蛋白質的純度，利用Bradford法檢測目的重組蛋白的濃度；之后將目的蛋白質作為抗原免疫家兔，進行多克隆抗體的制備；家兔免疫共需要4～5次，每次注射間隔7～10 d，并且按照皮下多點注射的原則每次至少注射200 ？滋g重組蛋白。首次免疫將蛋白質抗原與弗氏完全佐劑按1∶1（V∶V，下同）進行充分混合后注射，第二、第三次注射與弗氏不完全佐劑進行充分混合后注射，從第四次免疫開始直接注射蛋白質溶液[3]。利用Western Blot方法進行多克隆抗體的檢測。

1.2.3 重組蛋白質的細菌結合試驗 將進行細菌結合試驗的目的細菌菌株進行過夜培養，第二天低速離心收集細菌菌體，用500 ？滋L 1×PBS緩沖液懸起，加入經過1×PBS緩沖液透析的500 ？滋L目的蛋白質溶液（1 mg/mL），室溫條件下搖床孵育1 h；低速離心后用500 ？滋L 1×PBS緩沖液洗滌5次。之后用7% SDS溶液200 ？滋L孵育菌體，沉淀10 min，離心后收集最后的菌體沉淀和7%的SDS洗脫液。將第五次的1×PBS洗脫液、7%的SDS洗脫液、最后的菌體沉淀作為樣品進行SDS-PAGE，轉膜后利用Western Blot方法檢測結合試驗的效果，使用的抗體是重組Lv-SWD蛋白制備的多克隆抗體[4]。

2 結果與分析

2.1 重組Lv-SWD蛋白的純化與多克隆抗體的檢測結果

大腸桿菌表達菌株經過IPTG誘導能夠正確表達重組Lv-SWD蛋白，理論分子量為12.9 ku，由圖1可見，純化后蛋白條帶的大小接近14.3 ku，說明重組蛋白的大小與理論預測值相符。Western Blot分析結果（圖1）表明，重組Lv-SWD蛋白刺激家兔產生的多克隆抗體能夠較好的識別蛋白質本身。

2.2 細菌結合試驗結果

細菌結合試驗結果（圖2）表明，利用重組Lv-SWD蛋白制備的多克隆抗體識別醋酸纖維素薄膜后，4種細菌的菌體沉淀處都有明顯的條帶出現，說明巨大芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌以及弧菌都能較好的結合重組Lv-SWD蛋白。

3 小結與討論

目前，對于抗菌肽分子的研究比較深入，尤其是在甲殼類動物中的研究成果較多。在中國明對蝦、淡水小龍蝦、克氏原鰲蝦、南美白對蝦、斑節對蝦等動物中分別發現了甲殼肽、溶菌酶、抗脂多糖因子、對蝦素等免疫效應分子[5]，這些分子多數具有一定的先天免疫相關功能，包括抗菌活性、結合細菌活性、蛋白酶活性抑制作用等。通過研究這些分子的結構特征發現，一般情況下無脊椎動物先天免疫相關的抗菌肽分子具有廣泛的多樣性，包括結構多樣性與功能多樣性[6]。在結構方面，抗菌肽分子一般都包括一個典型的結構域，例如WAP結構域、對蝦素結構域、溶菌酶結構域，這些結構域的最重要特點就是具有成對出現的半胱氨酸殘基，數目一般在8個以上[7]。

為了進一步研究抗菌肽分子的結構與功能之間的聯系，本研究選擇了凡納對蝦的SWD分子進行了系統研究。凡納對蝦的SWD分子中存在一個單獨的WAP結構域，這個結構域主要由8個半胱氨酸殘基組成。通過結構預測發現，這8個半胱氨酸殘基可以形成4對二硫鍵，本研究在整個分子中形成一個球狀的實體結構和一個疏水的空穴。通過大腸桿菌原核表達，利用重組蛋白作為抗原，制備了多克隆抗體。從而對分子的細菌結合功能進行了研究，結合此前進行的蛋白酶活性抑制試驗，筆者發現重組的Lv-SWD蛋白具有抑制分泌型蛋白酶活性的作用，也存在直接結合細菌的功能，因此，推測在先天免疫系統中，Lv-SWD蛋白是一個重要的免疫效應分子，在對抗細菌的入侵過程中應該發揮著重要的功能。

參考文獻：

[1] DU Z Q，REN Q，ZHAO X F，et al.A double WAP domain （DWD）-containing protein with proteinase inhibitory activity in Chinese white shrimp， Fenneropenaeus chinensis[J]. Comparative Biochemistry and Physiology B： Biochemistry and Molecular Biology，2009，154（2）：203-210.

[2] DU Z Q，LI X C，WANG Z H，et al.A single WAP domain （SWD）-containing protein with antipathogenic relevance in red swamp crayfish， Procambarus clarkii[J]. Fish & Shellfish Immunology，2010，28（1）：134-142.

[3] SUN C，DU X J， XU W T，et al. Molecular cloning and characterization of three crustins from the Chinese white shrimp， Fenneropenaeus chinensis[J]. Fish & Shellfish Immunology，2010， 28（4）：517-524.

[4] LI X C，DU Z Q，LAN J F，et al. A novel pathogen-binding gC1qR homolog， FcgC1qR， in the Chinese white shrimp， Fenneropenaeus chinensis[J]. Dev Comp Immunol，2012，36（2）：400-407.

[5] KRUSONG K， POOLPIPAT P， SUPUNGUL P， et al. A comparative study of antimicrobial properties of crustinPm1 and crustinPm7 from the black tiger shrimp Penaeus monodon[J]. Dev Comp Immunol，2012，36（1）：208-215.

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[7] SMITH V J. Phylogeny of whey acidic protein（WAP）four-disulfide core proteins and their role in lower vertebrates and invertebrates[J]. Biochem Soc Trans，2011，39（5）：1403-1408.