黃精根莖高效離體再生體系的建立

黃登艷　陳澤雄

摘要：以黃精（Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute）根莖為試材，研究不同培養(yǎng)基組合對黃精根莖離體再生的影響。結(jié)果表明，黃精根莖最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+4.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA，最佳增殖培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L TDZ +0.1 mg/L IBA，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA +50 mg/L AC。

關(guān)鍵詞：黃精（Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute）；根莖；離體再生

中圖分類號(hào)：R282；Q813.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）05-1182-03

黃精（Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute）是百合科黃精屬（Polygonatum Mill.）多種植物根莖的總稱，為多年生宿根性草本藥用植物，其根莖是傳統(tǒng)中藥[1]。《中華人民共和國藥典》2005年版（一部）規(guī)定黃精、多花黃精（P. cyrtonema Hua）及滇黃精（P. kingianum Coll. et Hemsl.）3種植物為其原生藥來源[1]。黃精含多糖、氨基酸、蒽醌類化合物等成分，具有抗菌、降壓、抗衰老及治療風(fēng)濕痛等作用[2]。隨著黃精藥用價(jià)值和保健價(jià)值的開發(fā)，其原料的需求量也越來越大，導(dǎo)致對野生黃精的掠奪性采集，給黃精的開發(fā)利用和可持續(xù)發(fā)展帶來不利影響。因此，為了保證黃精原料來源，實(shí)行產(chǎn)業(yè)化種植勢在必行。李世等[3]對黃精的野生變家種栽培進(jìn)行了研究，而且有些地方也開始人工種植黃精[4，5]，但由于生產(chǎn)上多采用分根繁殖，其繁殖系數(shù)低，種根莖用量大，既不經(jīng)濟(jì)，又限制了黃精的產(chǎn)量，不便栽植管理與推廣，而且長期的分根無性繁殖容易引起黃精品種退化[6]，故黃精種苗問題成了人工大面積種植的瓶頸。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立黃精離體再生體系是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)黃精種苗的有效途徑，但通過組織培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)黃精產(chǎn)業(yè)化的研究鮮見報(bào)道。為此，筆者以黃精根莖為試材，研究了不同培養(yǎng)基組合對黃精離體再生的影響，以期為黃精離體再生體系的建立、產(chǎn)業(yè)化種植提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃精根莖由重慶市彭水縣林業(yè)局提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌體系的建立 選擇晴天挖取黃精根莖，刷掉黃精根莖泥土，用流水沖洗20～30 min，取2 cm左右的初生芽放進(jìn)洗衣粉溶液中浸泡3～5 min，再用流水沖洗干凈。將洗干凈的芽用 0.1%氯化汞處理10 min左右（視芽的老嫩程度而定），用無菌水清洗4次，將暴露在消毒液中的根莖組織切除，將芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2 芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的分裂素，不同種類的分裂素和生長素組合見表1。在表1培養(yǎng)基中均添加30 g/L蔗糖、4 g/L瓊脂，pH調(diào)至5.8，暗培養(yǎng)7 d后光照培養(yǎng)。每個(gè)處理接種30瓶，每瓶接種根莖1個(gè)，3次重復(fù)。30 d后觀察并統(tǒng)計(jì)其根莖的出芽率以及生長情況。篩選出適合黃精根莖的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件均為溫度（25±2） ℃，光照12 h/d，光照度1 500 lx。

1.2.3 增殖培養(yǎng) 將無菌體系中健康的小芽切成單芽，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基設(shè)計(jì)見表2。每個(gè)處理接種30瓶，每瓶接種根莖1個(gè)，3次重復(fù)。接種后40 d轉(zhuǎn)接1次，連續(xù)繼代3次后統(tǒng)計(jì)增殖率、平均成苗率及芽苗的生長情況。

1.2.4 生根培養(yǎng) 將增殖培養(yǎng)中健壯、高3～5 cm的不定芽帶少許老組織切割下來，接種到生根培養(yǎng)基上，分別選用MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA和IBA，蔗糖20 g/L，卡拉膠5 g/L。培養(yǎng)15 d后就陸續(xù)有根產(chǎn)生，繼續(xù)在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后觀察，統(tǒng)計(jì)其生根率、平均根數(shù)和平均根長。

生根率= 生根的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%

平均根數(shù)=生根總數(shù)/接種外植體數(shù)

平均根長=根的總長度/根的總數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素類型和濃度對黃精根莖芽誘導(dǎo)的影響

試驗(yàn)以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同類型和不同濃度的激素。為了篩選出適宜黃精根莖芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，設(shè)置了6種不同分裂素類型及濃度的組合，結(jié)果見表1。從表1可見，相同濃度不同激素類型的培養(yǎng)基對黃精根莖芽的誘導(dǎo)影響很大，添加6-BA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)率高于添加TDZ的培養(yǎng)基，當(dāng)6-BA的濃度達(dá)4.0 mg/L時(shí)，其誘導(dǎo)率達(dá)到最高，為82.22%，芽濃綠，生長快。相同激素類型不同濃度的培養(yǎng)基對黃精根莖芽誘導(dǎo)的影響也較大，隨著分裂素濃度的升高，其誘導(dǎo)率呈上升趨勢，芽的生長速度加快。因此，黃精根莖芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方為MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA組合（圖1）。

2.2 不同激素濃度組合對黃精根莖芽增殖的影響

黃精組織培養(yǎng)中芽的增殖數(shù)量直接影響組培效率和繁殖系數(shù)，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度組合的激素6-BA、TDZ、NAA和IBA對黃精根莖的芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接3代后統(tǒng)計(jì)其結(jié)果見表2。從表2可見，黃精根莖芽在添加激素組合為2.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L TDZ +0.1 mg/L IBA的培養(yǎng)基中長勢最好，其增殖系數(shù)達(dá)到最高，為2.69，平均株高最高為1.75 cm，并且增殖的芽健壯，葉片正常，生長速度快（圖2）。

6-BA和TDZ對黃精根莖芽增殖的影響均較大，當(dāng)6-BA濃度逐漸增加，TDZ的濃度逐漸降低時(shí)，其增殖系數(shù)先升高再降低；當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L，TDZ濃度為1.0 mg/L，且添加0.1 mg/L IBA時(shí)其增殖率最高，芽平均株高最高，芽的生長狀況最佳。當(dāng)再增加6-BA的濃度，同時(shí)降低TDZ的濃度，其增殖條數(shù)逐漸下降，芽的生長狀況也隨之變?nèi)酰仓瓴ＡЩ＞C合增殖系數(shù)，平均株高和芽的生長狀態(tài)，黃精根莖芽增殖的最佳培養(yǎng)基組合為MS+2.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L TDZ +0.1 mg/L IBA。

2.3 基本培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑對黃精根莖芽苗生根的影響

在1/2MS、MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑（NAA、IBA、6-BA）和活性炭（AC）對黃精進(jìn)行生根培養(yǎng)，選擇生長健壯、高3～5 cm的根莖芽切割下來，基部稍帶一點(diǎn)老組織，培養(yǎng)15 d后可見基部有白色的根系生長出來，30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。由表3可見，8種培養(yǎng)基都能使黃精根莖芽苗生根，但以1/2MS為基本培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合中生根情況普遍比MS為基本培養(yǎng)基的好。不同生長調(diào)節(jié)劑對黃精根莖芽苗生根的影響也較大，只添加NNA時(shí)比只添加IBA的生根率相對要高，葉型葉色正常；生根培養(yǎng)基C8中添加了少許分裂素6-BA，有利于黃精根莖芽苗的生根；生根培養(yǎng)基C3和C6中將NAA和IBA等濃度混合，并添加少量活性炭后生根率有明顯提高；當(dāng)生根培養(yǎng)基C3以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加0.5 mg/L NAA、0.5 mg/L IBA和50 mg/L AC時(shí)其生根率達(dá)到最高，為88.89%，平均根數(shù)為4.17條，平均根長為1.13 cm，并且芽健壯，葉型葉色正常（圖3）。因此，適合黃精根莖芽苗生根的培養(yǎng)基組合為1/2 MS+0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA +50 mg/L AC。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)黃精各器官發(fā)生的最佳培養(yǎng)基組合是不同的，說明不同器官的發(fā)生對同一植物生長調(diào)節(jié)劑的反應(yīng)不同。這和孫敬三等[7]的研究結(jié)果一樣，即器官發(fā)生和植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度有關(guān)，適合于芽分化及增殖的植物生長調(diào)節(jié)劑組合，在誘導(dǎo)根形成時(shí)，往往需要改變其種類和濃度，才能得到最佳效果。

在黃精的增殖過程中還發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度會(huì)直接影響芽的大小和增殖情況，當(dāng)蔗糖達(dá)到較高濃度60 g/L時(shí)，對芽的形成和生長有利，如蔗糖濃度降到30 g/L時(shí)，芽的數(shù)量明顯減少，并且很快抽出葉片長成完整植株，具體影響程度有待進(jìn)一步研究。

TDZ是具有很強(qiáng)細(xì)胞分裂素活性的人工合成激素，經(jīng)多種植物組織培養(yǎng)試驗(yàn)表明，對愈傷組織發(fā)生、離體芽增殖及再生有顯著的促進(jìn)作用，但對植物生根有抑制作用[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，TDZ對黃精根莖芽的誘導(dǎo)作用不如6-BA明顯，但在芽的增殖過程中添加適量的TDZ對黃精根莖芽的分化作用效果明顯。本試驗(yàn)得出適合黃精根莖芽增殖的培養(yǎng)基組合為MS+2.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L TDZ +0.1 mg/L IBA。

在誘導(dǎo)黃精根莖芽生根的過程中，基本培養(yǎng)基最為重要，直接影響其生根率和平均根數(shù)，生長素NAA 誘導(dǎo)生根的作用較IBA好，不但影響其生根率、平均根數(shù)，還直接影響芽苗的健康程度。本試驗(yàn)得出適合黃精根莖芽生根的最佳培養(yǎng)基組合為1/2 MS +0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA +50 mg/L AC。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[2] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1986.

[3] 李 世，郭學(xué)鑒，蘇淑欣，等.黃精野生變家種高產(chǎn)高效栽培技術(shù)研究[J].中國中藥雜志，1997，7（22）：398-401.

[4] 楊子龍，王世清，左敏.黃精高產(chǎn)栽培技術(shù)[J].安徽技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，16（1）：51-52.

[5] 宋東平，吳維春，丁志國.東北黃精栽培技術(shù)[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，2004（9）：21.

[6] 趙 致，龐玉新，袁媛，等.藥用作物黃精栽培研究進(jìn)展及栽培的幾個(gè)關(guān)鍵問題[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（1）：85-86.

[7] 孫敬三，朱至清.植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

[8] 徐華松，徐九龍，黃學(xué)林.TDZ在植物組織培養(yǎng)中的作用[J].廣西植物，1996，16（1）：77-80.

2.3 基本培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑對黃精根莖芽苗生根的影響

在1/2MS、MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑（NAA、IBA、6-BA）和活性炭（AC）對黃精進(jìn)行生根培養(yǎng)，選擇生長健壯、高3～5 cm的根莖芽切割下來，基部稍帶一點(diǎn)老組織，培養(yǎng)15 d后可見基部有白色的根系生長出來，30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。由表3可見，8種培養(yǎng)基都能使黃精根莖芽苗生根，但以1/2MS為基本培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合中生根情況普遍比MS為基本培養(yǎng)基的好。不同生長調(diào)節(jié)劑對黃精根莖芽苗生根的影響也較大，只添加NNA時(shí)比只添加IBA的生根率相對要高，葉型葉色正常；生根培養(yǎng)基C8中添加了少許分裂素6-BA，有利于黃精根莖芽苗的生根；生根培養(yǎng)基C3和C6中將NAA和IBA等濃度混合，并添加少量活性炭后生根率有明顯提高；當(dāng)生根培養(yǎng)基C3以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加0.5 mg/L NAA、0.5 mg/L IBA和50 mg/L AC時(shí)其生根率達(dá)到最高，為88.89%，平均根數(shù)為4.17條，平均根長為1.13 cm，并且芽健壯，葉型葉色正常（圖3）。因此，適合黃精根莖芽苗生根的培養(yǎng)基組合為1/2 MS+0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA +50 mg/L AC。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)黃精各器官發(fā)生的最佳培養(yǎng)基組合是不同的，說明不同器官的發(fā)生對同一植物生長調(diào)節(jié)劑的反應(yīng)不同。這和孫敬三等[7]的研究結(jié)果一樣，即器官發(fā)生和植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度有關(guān)，適合于芽分化及增殖的植物生長調(diào)節(jié)劑組合，在誘導(dǎo)根形成時(shí)，往往需要改變其種類和濃度，才能得到最佳效果。

在黃精的增殖過程中還發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度會(huì)直接影響芽的大小和增殖情況，當(dāng)蔗糖達(dá)到較高濃度60 g/L時(shí)，對芽的形成和生長有利，如蔗糖濃度降到30 g/L時(shí)，芽的數(shù)量明顯減少，并且很快抽出葉片長成完整植株，具體影響程度有待進(jìn)一步研究。

TDZ是具有很強(qiáng)細(xì)胞分裂素活性的人工合成激素，經(jīng)多種植物組織培養(yǎng)試驗(yàn)表明，對愈傷組織發(fā)生、離體芽增殖及再生有顯著的促進(jìn)作用，但對植物生根有抑制作用[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，TDZ對黃精根莖芽的誘導(dǎo)作用不如6-BA明顯，但在芽的增殖過程中添加適量的TDZ對黃精根莖芽的分化作用效果明顯。本試驗(yàn)得出適合黃精根莖芽增殖的培養(yǎng)基組合為MS+2.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L TDZ +0.1 mg/L IBA。

在誘導(dǎo)黃精根莖芽生根的過程中，基本培養(yǎng)基最為重要，直接影響其生根率和平均根數(shù)，生長素NAA 誘導(dǎo)生根的作用較IBA好，不但影響其生根率、平均根數(shù)，還直接影響芽苗的健康程度。本試驗(yàn)得出適合黃精根莖芽生根的最佳培養(yǎng)基組合為1/2 MS +0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA +50 mg/L AC。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[2] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1986.

[3] 李 世，郭學(xué)鑒，蘇淑欣，等.黃精野生變家種高產(chǎn)高效栽培技術(shù)研究[J].中國中藥雜志，1997，7（22）：398-401.

[4] 楊子龍，王世清，左敏.黃精高產(chǎn)栽培技術(shù)[J].安徽技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，16（1）：51-52.

[5] 宋東平，吳維春，丁志國.東北黃精栽培技術(shù)[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，2004（9）：21.

[6] 趙 致，龐玉新，袁媛，等.藥用作物黃精栽培研究進(jìn)展及栽培的幾個(gè)關(guān)鍵問題[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（1）：85-86.

[7] 孫敬三，朱至清.植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

[8] 徐華松，徐九龍，黃學(xué)林.TDZ在植物組織培養(yǎng)中的作用[J].廣西植物，1996，16（1）：77-80.

2.3 基本培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑對黃精根莖芽苗生根的影響

在1/2MS、MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑（NAA、IBA、6-BA）和活性炭（AC）對黃精進(jìn)行生根培養(yǎng)，選擇生長健壯、高3～5 cm的根莖芽切割下來，基部稍帶一點(diǎn)老組織，培養(yǎng)15 d后可見基部有白色的根系生長出來，30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。由表3可見，8種培養(yǎng)基都能使黃精根莖芽苗生根，但以1/2MS為基本培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合中生根情況普遍比MS為基本培養(yǎng)基的好。不同生長調(diào)節(jié)劑對黃精根莖芽苗生根的影響也較大，只添加NNA時(shí)比只添加IBA的生根率相對要高，葉型葉色正常；生根培養(yǎng)基C8中添加了少許分裂素6-BA，有利于黃精根莖芽苗的生根；生根培養(yǎng)基C3和C6中將NAA和IBA等濃度混合，并添加少量活性炭后生根率有明顯提高；當(dāng)生根培養(yǎng)基C3以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加0.5 mg/L NAA、0.5 mg/L IBA和50 mg/L AC時(shí)其生根率達(dá)到最高，為88.89%，平均根數(shù)為4.17條，平均根長為1.13 cm，并且芽健壯，葉型葉色正常（圖3）。因此，適合黃精根莖芽苗生根的培養(yǎng)基組合為1/2 MS+0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA +50 mg/L AC。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)黃精各器官發(fā)生的最佳培養(yǎng)基組合是不同的，說明不同器官的發(fā)生對同一植物生長調(diào)節(jié)劑的反應(yīng)不同。這和孫敬三等[7]的研究結(jié)果一樣，即器官發(fā)生和植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度有關(guān)，適合于芽分化及增殖的植物生長調(diào)節(jié)劑組合，在誘導(dǎo)根形成時(shí)，往往需要改變其種類和濃度，才能得到最佳效果。

在黃精的增殖過程中還發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度會(huì)直接影響芽的大小和增殖情況，當(dāng)蔗糖達(dá)到較高濃度60 g/L時(shí)，對芽的形成和生長有利，如蔗糖濃度降到30 g/L時(shí)，芽的數(shù)量明顯減少，并且很快抽出葉片長成完整植株，具體影響程度有待進(jìn)一步研究。

TDZ是具有很強(qiáng)細(xì)胞分裂素活性的人工合成激素，經(jīng)多種植物組織培養(yǎng)試驗(yàn)表明，對愈傷組織發(fā)生、離體芽增殖及再生有顯著的促進(jìn)作用，但對植物生根有抑制作用[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，TDZ對黃精根莖芽的誘導(dǎo)作用不如6-BA明顯，但在芽的增殖過程中添加適量的TDZ對黃精根莖芽的分化作用效果明顯。本試驗(yàn)得出適合黃精根莖芽增殖的培養(yǎng)基組合為MS+2.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L TDZ +0.1 mg/L IBA。

在誘導(dǎo)黃精根莖芽生根的過程中，基本培養(yǎng)基最為重要，直接影響其生根率和平均根數(shù)，生長素NAA 誘導(dǎo)生根的作用較IBA好，不但影響其生根率、平均根數(shù)，還直接影響芽苗的健康程度。本試驗(yàn)得出適合黃精根莖芽生根的最佳培養(yǎng)基組合為1/2 MS +0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L IBA +50 mg/L AC。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[2] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1986.

[3] 李 世，郭學(xué)鑒，蘇淑欣，等.黃精野生變家種高產(chǎn)高效栽培技術(shù)研究[J].中國中藥雜志，1997，7（22）：398-401.

[4] 楊子龍，王世清，左敏.黃精高產(chǎn)栽培技術(shù)[J].安徽技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，16（1）：51-52.

[5] 宋東平，吳維春，丁志國.東北黃精栽培技術(shù)[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，2004（9）：21.

[6] 趙 致，龐玉新，袁媛，等.藥用作物黃精栽培研究進(jìn)展及栽培的幾個(gè)關(guān)鍵問題[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（1）：85-86.

[7] 孫敬三，朱至清.植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

[8] 徐華松，徐九龍，黃學(xué)林.TDZ在植物組織培養(yǎng)中的作用[J].廣西植物，1996，16（1）：77-80.