D—甘露糖電化學阻抗生物傳感器的研究

鄒蕊　馬貴

摘要：糖類的研究已經成為生物及化學領域一個新的熱點。凝集素與糖類之間的作用是生命活動中一個重要的部分。試驗設計了一種比較簡單的D-甘露糖電化學阻抗傳感器，以刀豆凝集素為分子識別物質，共價鍵合法將刀豆凝集素固定到金圓盤電極的表面，用電化學阻抗法進行檢測。結果表明，以

[Fe（CN）6]3-/4-氧化還原電對作為探針，電子轉移阻抗變化值與D-甘露糖的濃度之間呈現良好的線性關系。

關鍵詞：電化學傳感器；阻抗；刀豆凝集素；D-甘露糖

中圖分類號：TP212.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-1136-03

細胞表面的糖化合物不僅在正常細胞的識別、細胞黏附和細胞間信號傳導等方面具有重要作用，而且在細胞病變、病原感染等研究方面亦有重要意義。因此，研究生物體內糖類物質的變化是一個非常重要的問題。近幾年來，凝集素與糖類物質之間特異性的相互作用引起了人們廣泛的關注。利用凝集素結合特性可以提供糖鏈末端結構的信息，且具有特異、敏感、快速的特點[1]。本試驗設計了以刀豆凝集素為分子識別物質，測定D-甘露糖的電化學交流阻抗生物傳感器。電化學交流阻抗技術是一種對電極界面性質變化十分敏感而便捷的檢測技術，能夠提供有關電極界面電子傳遞電阻，雙電層電容等多種界面參數的大量信息，而且是一種非標記的技術，具有簡單且無需標記等優點[2]。試驗利用刀豆凝集素與甘露糖的特異性相互作用，將半胱氨酸固定到電極表面之后，在N-（3-二甲氨基）-N-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）的作用下，將半胱氨酸的羧基轉化為酰基[3]，然后與刀豆凝集素的氨基形成酰氨鍵，從而將刀豆凝集素固定到電極表面，以檢測甘露糖。該傳感器電子轉移阻抗改變值與D-甘露糖的濃度之間呈現良好的線性關系，為D-甘露糖的檢測提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

刀豆凝集素A（Concanavalin A，ConA）、N-（3-二甲氨基丙基）-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[N-（3-Dimethylaminopropyl）-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]購自Sigma公司；D-甘露糖 （C6H12O6）、半胱氨酸（Cysteine，CS）購自Alfa Aesar公司。N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccimide，NHS）購自上海麗珠東風生物技術有限公司。緩沖液為0.10 mol/L磷酸緩沖溶液（PBS，pH 7.40）-10 mmol/L KCl。用0.10 mol/L PBS（pH 7.40）來配制5 mmol/L K3[Fe（CN）6]-5 mmol/L K4[Fe（CN）6]檢測溶液。

NHS和EDC均使用0.10 mol/L PBS-10 mol/L KCl （pH 7.40）配制。其他試劑均為分析純，試驗所用溶液均用超純水配制。

刀豆凝集素的活化[4]：刀豆凝集素使用前用0.1 mmol/ L的Ca2+、Mn2+活化6 h。

電化學分析系統：CHI 660電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）。電極為三電極系統，工作電極為金圓盤電極（Φ=2.0 mm），對極為鉑絲，參比電極為銀/氯化銀電極（Ag/AgCl 飽和KCl）。

1.2 金圓盤電極預處理

將金電極用0.03 ？滋m Al2O3溶膠研磨，然后用水沖洗；再將沖洗后的金電極在0.10 mol /L H2SO4溶液中在電位范圍0～1.6 V，循環伏安掃描直到得到標準金的還原峰，用二次水沖洗干凈備用[5]。

1.3 生物傳感器的制備

將預處理好的金電極浸入0.02 mol/L半胱胺酸溶液中浸泡16 h，然后用水沖洗，使金電極表面形成帶正電的自組裝膜[1]（CS/Au），再將100 μL 40 mmol/L的EDC和10 mmol/ L的NHS的混合溶液滴加在CS/金電極上，使金電極表面的半胱胺酸得到活化，室溫下靜置1 h[6]，然后用水沖洗（EDC-NHS/CS/ Au）；再將活化后的CS/金電極在ConA溶液中浸泡1 h，利用活化后的CS與帶氨基的ConA共價鍵合結合，將ConA共價鍵合法固定在電極表面制備成傳感器（ConA/EDC-NHS/CS/ Au），如圖1所示。待用。

2 結果與分析

2.1 循環伏安法表征

圖2為傳感器制備過程中，不同修飾電極在5 mmol /L K3[Fe（CN）6]-5 mmol/L K4[Fe（CN）6]中的循環伏安圖。從圖2中可以看出，裸金電極的氧化還原峰電位差△E=0.083 1 V，當在金電極自組裝了CS后，EDC+NHS/CS/Au上固定了刀豆凝集素之后，[Fe（CN）6]3-/4-平衡電對的氧化峰電流降低，原因是刀豆凝集素的等電點pI為4.5～5.0，在中性條件下（pH 7.40）會帶負電，因此，對荷負電的[Fe（CN）6]3-/4-平衡電對存在靜電排斥作用，使得氧化電流較固定有EDC+NHS/CS/Au的電極降低。當加入D-甘露糖之后，[Fe（CN）6]3-/4-平衡電對的氧化峰電流繼續降低。這可能是由于刀豆凝集素結合D-甘露糖之后，空間位阻變大，導致[Fe（CN）6]3-/4-平衡電對在電極上的電子轉移受到阻礙。

2.2 交流阻抗法表征

圖3為傳感器制備過程中，不同修飾電極在5 mmol/L K3[Fe（CN）6]-5 mmol/L K4[Fe（CN）6]中的復平面阻抗圖。從圖3可以看出，EDC+NHS/CS/Au的阻抗譜幾乎為一直線，表明在此情況下，反應是受擴散控制的過程，平衡電對非常容易到達電極的表面發生反應，電極上不存在阻擋電子傳遞的物質。這說明羧基酰基化后帶正電，吸引電子，阻抗值變小。而當結合ConA之后，Nyquist圖上高頻區半圓增大。這一現象歸因于ConA本身分子比較大，電極表面的空間位阻就會變大，阻礙平衡電對向電極表面傳遞，使表面電子傳遞電阻Ret增大。

從不同電極的循環伏安圖及交流阻抗圖中可以看出，在ConA固定到電極的過程中，電極表面的阻抗增大，電子傳遞速度變慢，而不同濃度的甘露糖結合到電極上之后，也會引起阻抗值的變化，這表明本試驗設計的D-甘露糖電化學交流阻抗傳感器能用于甘露糖的檢測。

2.3 傳感器的線性范圍

利用共價鍵合法制備電化學傳感器對不同濃度的D-甘露糖進行測定。圖4為EDC+NHS/ConA/CS/金電極對不同濃度的D-甘露糖在5 mmol/L K3[Fe（CN）6]-5 mmol/LK4[Fe（CN）6]中的交流阻抗圖，內插圖為阻抗差值與D-甘露糖濃度對數值之間的線性關系圖。從圖4中可見，EDC加NHS共價鍵和來固定刀豆凝集素的方法在甘露糖為5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈良好的線性關系。阻抗差值（y）與D-甘露糖的濃度（x，mol/L）在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間也呈良好的線性關系，其線性回歸方程為y=521.5x+4 486.7，線性相關系數為0.975 7。

3 結論

本試驗通過共價鍵和的方式，將刀豆凝集素固定到金電極的表面，研制了一種簡單、靈敏的測定D-甘露糖的電化學阻抗傳感器。該傳感器電子轉移阻抗改變值與D-甘露糖的濃度在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈現良好的線性關系。試驗結果表明，刀豆凝集素與甘露糖的特異性相互作用能夠應用于對甘露糖的定量檢測，并獲得了較高的靈敏度，為D-甘露糖的檢測提供了新思路。

參考文獻：

[1] 黎振華，羊小海，王 青，等.伴刀豆球蛋白A/葡聚糖修飾的金納米顆粒自組裝膜增強信號的表面等離子體共振葡萄糖傳感器[J].化學傳感器，2002，27（1）：23-27.

[2] LI X X，SHEN L H，ZHANG C X，et al. Electrochemical impedance spectroscopy for study of aptamer-thrombin interfacial interactions[J]. Biosensors and Bioelectronics， 2008， 23（11）：1624-1630.

[3] BELLE J T， GERLACH J Q， SVROVSKY S，et al. Label-free lmpedimetric detection of glycan lectin interactions[J]. Anal Chem，2007，79（18）：6959-6964.

[4] 李揚眉，陳志春，呂德水，等.辣根過氧化物酶活性膜結構及生物電催化性能[J].物理化學學報，2003，19（5）：474-477.

[5] ZHANG C X，HARUYAMA T，AIZAWA M， et al.Evaluation of substituted-1，10-phenanthroline complexes of osmium as mediator for glucose oxidase of Aspergillus niger[J].Analytica Chimica Acta.，2000，408（1-2）：225-232.

[6] 郭萌萌，楊云慧，王志杰，等. 基于伴刀豆球蛋白固定過氧化物酶無介體新型生物傳感器的研制[J].分析化學，2006，34（3）：399-402.

從不同電極的循環伏安圖及交流阻抗圖中可以看出，在ConA固定到電極的過程中，電極表面的阻抗增大，電子傳遞速度變慢，而不同濃度的甘露糖結合到電極上之后，也會引起阻抗值的變化，這表明本試驗設計的D-甘露糖電化學交流阻抗傳感器能用于甘露糖的檢測。

2.3 傳感器的線性范圍

利用共價鍵合法制備電化學傳感器對不同濃度的D-甘露糖進行測定。圖4為EDC+NHS/ConA/CS/金電極對不同濃度的D-甘露糖在5 mmol/L K3[Fe（CN）6]-5 mmol/LK4[Fe（CN）6]中的交流阻抗圖，內插圖為阻抗差值與D-甘露糖濃度對數值之間的線性關系圖。從圖4中可見，EDC加NHS共價鍵和來固定刀豆凝集素的方法在甘露糖為5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈良好的線性關系。阻抗差值（y）與D-甘露糖的濃度（x，mol/L）在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間也呈良好的線性關系，其線性回歸方程為y=521.5x+4 486.7，線性相關系數為0.975 7。

3 結論

本試驗通過共價鍵和的方式，將刀豆凝集素固定到金電極的表面，研制了一種簡單、靈敏的測定D-甘露糖的電化學阻抗傳感器。該傳感器電子轉移阻抗改變值與D-甘露糖的濃度在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈現良好的線性關系。試驗結果表明，刀豆凝集素與甘露糖的特異性相互作用能夠應用于對甘露糖的定量檢測，并獲得了較高的靈敏度，為D-甘露糖的檢測提供了新思路。

參考文獻：

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[6] 郭萌萌，楊云慧，王志杰，等. 基于伴刀豆球蛋白固定過氧化物酶無介體新型生物傳感器的研制[J].分析化學，2006，34（3）：399-402.

從不同電極的循環伏安圖及交流阻抗圖中可以看出，在ConA固定到電極的過程中，電極表面的阻抗增大，電子傳遞速度變慢，而不同濃度的甘露糖結合到電極上之后，也會引起阻抗值的變化，這表明本試驗設計的D-甘露糖電化學交流阻抗傳感器能用于甘露糖的檢測。

2.3 傳感器的線性范圍

利用共價鍵合法制備電化學傳感器對不同濃度的D-甘露糖進行測定。圖4為EDC+NHS/ConA/CS/金電極對不同濃度的D-甘露糖在5 mmol/L K3[Fe（CN）6]-5 mmol/LK4[Fe（CN）6]中的交流阻抗圖，內插圖為阻抗差值與D-甘露糖濃度對數值之間的線性關系圖。從圖4中可見，EDC加NHS共價鍵和來固定刀豆凝集素的方法在甘露糖為5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈良好的線性關系。阻抗差值（y）與D-甘露糖的濃度（x，mol/L）在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間也呈良好的線性關系，其線性回歸方程為y=521.5x+4 486.7，線性相關系數為0.975 7。

3 結論

本試驗通過共價鍵和的方式，將刀豆凝集素固定到金電極的表面，研制了一種簡單、靈敏的測定D-甘露糖的電化學阻抗傳感器。該傳感器電子轉移阻抗改變值與D-甘露糖的濃度在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈現良好的線性關系。試驗結果表明，刀豆凝集素與甘露糖的特異性相互作用能夠應用于對甘露糖的定量檢測，并獲得了較高的靈敏度，為D-甘露糖的檢測提供了新思路。

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[5] ZHANG C X，HARUYAMA T，AIZAWA M， et al.Evaluation of substituted-1，10-phenanthroline complexes of osmium as mediator for glucose oxidase of Aspergillus niger[J].Analytica Chimica Acta.，2000，408（1-2）：225-232.

[6] 郭萌萌，楊云慧，王志杰，等. 基于伴刀豆球蛋白固定過氧化物酶無介體新型生物傳感器的研制[J].分析化學，2006，34（3）：399-402.