東莨菪內酯對家蠶乙酰膽堿酯酶活性的影響

倪婧　達愛斯　謝道燕　柴建萍　江秀均　黃平　羅雁婕

摘要：用不同濃度天然產物東莨菪內酯處理桑葉飼喂家蠶（Bombyx mori）后，通過測定家蠶頭部乙酰膽堿酯酶（AChE）活性，研究東莨菪內酯對家蠶的影響。結果表明，12 h時家蠶出現擺頭、吐液等輕微中毒癥狀，24 h時中毒癥狀減輕，48 h時中毒癥狀消失，家蠶恢復正常；5齡第三天家蠶飼喂浸過不同濃度東莨菪內酯的桑葉后，頭部AChE比活力變化趨勢與對照變化趨勢相反，且除了藥后24 h時的比活力高于對照外，其余時間段比活力均顯著低于對照，表現為抑制作用；在一定濃度范圍內，東莨菪內酯對家蠶頭部離體AChE活性的抑制作用呈劑量效應關系，且抑制率隨東莨菪內酯濃度的升高而升高。5.0×10-2、

2.5×10-2 mol/L東莨菪內酯對家蠶頭部離體AChE活性的抑制率分別達到99.4%、90.6%，當東莨菪內酯濃度小于5.0×10-4 mol/L時，其對家蠶頭部離體AChE活性的抑制趨勢逐漸變緩，抑制中濃度IC50為4.03×10-3 mol/L。

關鍵詞：東莨菪內酯；家蠶（Bombyx mori）；乙酰膽堿酯酶

中圖分類號：S881.2； S482.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-1106-03

乙酰膽堿酯酶（Acetyleholinesterase，AChE）是昆蟲神經系統中最重要的酶系之一，在中樞及外周神經系統中與乙酰膽堿受體一起參與完成神經-神經、神經-肌肉突觸之間動作電位的傳遞，其主要生理功能是催化水解陽離子性神經遞質乙酰膽堿，維持神經沖動正常傳遞[1]。若乙酰膽堿酯酶與殺蟲劑接觸，其活性部位與殺蟲劑不可逆地結合，導致乙酰膽堿不能被水解，酶失活，乙酰膽堿在突觸處積累，過量的乙酰膽堿造成去極化阻斷，從而抑制正常的神經傳導，導致昆蟲中毒死亡[2，3]。東莨菪內酯（Scopoletin）又稱莨菪亭、莨菪酚、東莨菪甙元、7-羥基-6-甲氧基香豆素等，是廣泛存在于植物中的香豆素類化合物，大部分的藥用東莨菪素是從傘形科植物防風、白云花和旋花科植物丁公藤和光葉丁公藤中提取而來[4]，是一種天然產物，且在桑樹的葉、根、皮中也含有此類物質。

研究表明，有機磷、氨基甲酸酯類農藥對乙酰膽堿酯酶（AChE）有強烈的抑制作用[5-7]。在天然產物活性物質中，AChE的酯動部位抑制劑毒扁豆

堿 [8，9]，以其為模板合成的氨基甲酸酯類農藥已經成為一種農藥生產上的主要殺蟲劑。但東莨菪內酯對昆蟲體內乙酰膽堿酯酶的活性影響研究的報道較少，本研究選擇鱗翅目模式生物昆蟲家蠶（Bombyx mori）作為研究對象，通過研究東莨菪內酯對家蠶活體和離體乙酰膽堿酯酶活性的影響，為進一步探討東莨菪內酯殺蟲機理提供參考，為以后開發既不影響家蠶正常生長發育又能防治桑樹害蟲的東莨菪素類植物源殺蟲劑提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

家蠶品種：菁松×皓月，由云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所提供。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：東莨菪內酯（Scopoletin），由西南大學植保學院天然產物農藥研究室提供；

1.6 mmol/L 碘化硫代乙酰膽堿（Acetylthiocholine iodide，ATChI），ACROS ORGANICS公司生產；5，5-二硫代雙硝基苯甲酸[5，5-dithio-bis （2-nitrobenzoic acid）]（DTNB），Damas-beta公司生產；1 mg/mL牛血清白蛋白標準品（Albumin bovine serum），云科生物工程公司生產；考馬斯亮藍G-250，北京索萊寶科技有限公司生產。

主要儀器：高速冷凍離心機、xMark酶標儀、玻璃勻漿器。

1.3 活體抑制施藥方法

采用浸葉法，將新鮮桑葉分別浸入不同濃度（0.104、0.078、0.052、0.026 mol/L）的東莨菪內酯藥液中，葉片全部浸濕，對照以蒸餾水浸葉，10 s后取出室溫條件下自然晾干，按正常的飼喂量飼喂5齡第三天家蠶，每個濃度3次重復，飼喂3 h后，去除未吃盡的桑葉，之后以新鮮無毒桑葉飼喂，觀察家蠶中毒癥狀，且每隔8 h取家蠶于-80 ℃冰箱保存待用，至48 h，共取樣6次。

1.4 活體抑制粗酶液制備

將所取樣品家蠶頭部剪下，0.9% NaCl生理鹽水清洗，以1：5（m：V）的比例于0.01 mol/L磷酸緩沖液（1 mmol/L EDTA，l% TritonX-100，1 mol/L NaCl，pH 8.0）冰浴，研磨成勻漿，勻漿液于4 ℃，15 000 r/min離心20 min，取上清液作為待測酶液。

1.5 蛋白質及AChE活性測定

1.5.1 酶源蛋白質含量測定 參照文獻[10]中的考馬斯亮藍G-250法測定酶源蛋白質含量，以牛血清蛋白為標準蛋白。

1.5.2 AChE活性測定 參照張瑩等[11]的酶活性測定方法，以0.8 mmol/L碘化硫代乙酰膽堿（ATChI）為反應底物，0.125 mmol/L 5，5-二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）為顯色劑。取待測酶液50 ？滋L與100 ？滋L ATChI底物混勻放在40 ℃酶標儀中保溫10 min后，加入100 ？滋L DTNB顯色劑顯色并終止反應，在412 nm下測定光密度（OD），按（1）式計算AChE的比活力[2，12]。

AChE 比活力=■ （1）

式中，V表示反應體系的總體積（mL）；S表示反應體系中所加酶液體積（mL）；M表示反應體系中AChE的實際蛋白質含量（mg）；消光系數 e=13.6；光程L=1 cm。

1.5.3 AChE離體活性測定 提取正常條件下飼養至5齡第三天家蠶頭部粗酶液待用，配制5.0×10-2、2.5×10-2、5.0×10-3、2.5×10-3、5.0×10-4、2.5×10-4、5.0×10-5、2.5×10-5 mol/L系列濃度東莨菪內酯抑制劑（0.05 mol/L磷酸緩沖液稀釋），參照文獻[13]的方法測定AChE殘余活力，根據公式（2）計算抑制率[2，14]，每個處理設1個空白和3次重復。

抑制率 =[OD對照-（OD處理-OD空白）]/ OD對照×100% （2）

式中，OD處理指待測液中添加酶液和抑制劑；OD空白指待測液中不添加酶液，添加與處理相同濃度的東莨菪內酯抑制劑；OD對照指待測液中添加酶液，未添加抑制劑。

1.6 數據分析

運用SPSS 13.0軟件的Probit模塊對試驗結果進行分析，求出乙酰膽堿酯酶（AChE）比活力、抑制率、得出回歸方程及IC50值。

2 結果與分析

2.1 家蠶中毒癥狀

用東莨菪內酯處理過的桑葉飼喂家蠶，3 h后觀察到大部分藥劑處理過的桑葉被家蠶取食，但家蠶未表現出中毒癥狀；移除未吃盡桑葉，之后以新鮮無毒桑葉飼喂，12 h時觀察到食下高濃度（0.104、0.078 mol/L）東莨菪內酯處理葉片的部分家蠶出現擺頭現象，與對照相比行動遲緩，少數靜臥在桑葉上，有輕微吐液，且取食量少于對照，食下低濃度（0.052、0.026 mol/L）處理葉片的家蠶中毒癥狀較輕；24 h時觀察到大多數家蠶中毒癥狀減輕，且取食量較12 h時增加；48 h時觀察到擺頭、吐液等中毒癥狀消失，家蠶基本恢復正常狀態，與對照相比差異不大。在整個中毒過程中沒有出現家蠶死亡的現象。

2.2 東莨菪內酯對家蠶頭部AChE活性的影響

東莨菪內酯對家蠶頭部AChE活性的影響如圖1所示。家蠶食下毒葉后，8 h時測得各濃度處理后的家蠶頭部AChE比活力與對照差異不大，16 h與對照相比顯著降低，且東莨菪內酯濃度越高AChE比活力越低；24 h時各濃度處理后的AChE比活力均比16 h時升高且都高于對照；32 h時對照AChE比活力比24 h時顯著升高，但各濃度處理后的AChE比活力比24 h時降低，與對照差異較大，之后各濃度處理后的AChE比活力逐漸降低，且差異不大，但都顯著低于對照。總體來看，添食東莨菪內酯處理的毒葉后，家蠶頭部AChE比活力變化趨勢與對照變化趨勢相反，說明東莨菪內酯對家蠶頭部AChE活性有一定影響，且表現為抑制AChE活性，并隨東莨菪內酯濃度的升高，AChE受抑制作用增強。

2.3 東莨菪內酯對家蠶離體AChE活性的影響

測定不同濃度東莨菪內酯作用下家蠶頭部離體AChE的抑制活性，按公式（2）計算出抑制率，以抑制率對抑制劑濃度的負對數作圖，如圖2所示。東莨菪內酯在一定濃度范圍內對家蠶頭部離體AChE活性的抑制作用呈明顯的劑量-效應關系，且對AChE活性的抑制率隨東莨菪內酯濃度的升高而升高。5.0×10-2 、2.5×10-2 mol/L東莨菪內酯對家蠶頭部離體AChE活性的抑制率分別達到99.4%和90.6%，當東莨菪內酯濃度小于5.0×10-4 mol/L后，其對家蠶頭部離體AChE活性的抑制趨勢逐漸變緩。根據藥劑對AChE活性抑制的劑量-效應關系，求出東莨菪內酯對家蠶頭部離體AChE的回歸方程為y=1.689x+4.045，抑制中濃度IC50值為4.03×10-3 mol/L。

3 討論

東莨菪內酯屬香豆素類化合物，廣泛存在于丁公藤、地骨皮、白芷、胡盧巴、黃花敗醬、桑樹等多種常見植物中，是從植物中提取的天然產物。在醫藥領域，根據公認的病理-膽堿能缺失學說，已有大量研究表明，通過東莨菪內酯抑制乙酰膽堿酯酶活性，降低乙酰膽堿酯酶水解乙酰膽堿的能力，增加腦內乙酰膽堿含量，可有效治療阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD），即老年癡呆癥[15-17]。Furey等[18]研究發現靜脈注射東莨菪堿（4 μg/kg）可以迅速減輕抑郁癥患者的抑郁程度，劉悅等[19]也研究發現東莨菪堿能夠有效改善網癮患者伴發的抑郁癥狀。通過此類相關研究可明確，乙酰膽堿酯酶不僅是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標，也是東莨菪內酯的作用靶標。也有研究表明，東莨菪內酯對桑園害螨——朱砂葉螨有觸殺作用，且能顯著抑制朱砂葉螨乙酰膽堿酯酶、單胺氧化酶、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，其LC30、LC50、LC90值分別為0.872、1.243、2.956 mg/mL[20]，可作為植物源殺螨劑進一步開發利用。

4 結論

本研究結果表明，東莨菪內酯在較高濃度（0.104、0.078 mog/L）時可引起家蠶輕微中毒癥狀，低濃度（0.052、0.026 mog/L）時觀察到的中毒癥狀不明顯，且中毒癥狀均在48 h后消失，家蠶恢復正常；東莨菪內酯對家蠶頭部AChE活性表現出抑制作用，且抑制作用隨東莨菪內酯濃度升高而增強。綜合觀察結果和試驗結果，雖然高濃度東莨菪內酯在一定程度上會引起家蠶輕微中毒，但是低濃度沒有觀察到明顯的中毒癥狀，在桑園中如果選用適當濃度東莨菪內酯作為植物源殺蟲劑，既能保證桑葉對家蠶的安全性，又能防治桑園害螨，為進一步研究東莨菪內酯在桑園害蟲防控方面奠定基礎。

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