重慶煙區硅酸鹽細菌的分離鑒定及生理生化特性

楊笑笑　李振輪　王晗　李娜

摘要：采用土壤稀釋平板法從重慶市彭水縣的植煙土壤樣品中分離出8株具有解鉀能力的細菌，通過測定其對含鉀礦石中有效鉀的釋放能力，篩選出兩株具有較強的解鉀能力的硅酸鹽細菌，運用分子生物學方法對這兩株硅酸鹽細菌的16～23S rDNA序列進行擴增并鑒定。結果表明，一株細菌屬于膠質類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus），另一株細菌屬于短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis），并且研究了這兩株細菌的生理生化特性。

關鍵詞：硅酸鹽細菌；分離鑒定；生理生化特性；重慶煙區

中圖分類號：Q939.96 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-1013-04

土壤是一個天然鉀庫，每公頃土壤耕層含鉀量約為26.1 t，而90%～98%以上的鉀素存在于鉀長石和云母等富含硅酸鹽的礦物中，其中的鉀素多以緩效態存在，不能直接被農作物利用，能被植物吸收利用的可溶性速效鉀含量約占農作物總需求量的5%和土壤總鉀量的0.1%～0.2% [1]。因此，我國土壤既富含鉀又缺鉀，總體呈現出可溶性速效鉀素缺乏的現象。有關資料顯示，中國的鉀肥產量占世界的0.34%，而消耗量占14.7%，可見我國鉀素資源短缺，多依賴于進口[2]。以多種形式補充土壤中的可溶性速效鉀素，科學合理施用鉀肥已成為農業生產中的主要技術措施之一[3]。發掘土壤中具有解鉀能力的微生物，將其應用于可溶性速效鉀素的釋放，提高土壤中可利用鉀素的含量，是近些年鉀肥研究領域的熱點。相關報道表明，解鉀細菌多是硅酸鹽細菌，它能夠分解硅酸鹽類礦物并協同釋放出鉀等元素供植物利用，將土壤礦物中緩效態鉀素轉化為可溶性速效鉀素，兼具固氮、解磷功能[4]，并且該類細菌對營養成分要求不高，廣泛分布于土壤中，是一種良好的功能菌[5]。因此，在化學鉀肥供應不足的大環境下，以解鉀菌的相關研究為基礎，研發出效果好、成本低且環境友好的微生物肥料，進一步挖掘土壤中的鉀素資源，具有重要的科學和實際意義。

近年來，對硅酸鹽細菌解鉀的研究，大致集中于4個方面[6] ： 一是解鉀的效果研究；二是解鉀的條件，包括土壤條件和環境條件的研究；三是解鉀的機理研究；四是實際投入運用研究。硅酸鹽細菌解鉀的效果研究處于首要地位，即篩選出一些解鉀能力較強的菌株，目前國內外的研究大都處于這一階段。

我國西南地區是重要的農作物及經濟作物產地，其地理位置、生態環境和土壤條件具有特殊性，土壤中礦物鉀的含量豐富，但是可供植物直接利用的可溶性鉀含量較低。本試驗主要從重慶彭水縣植煙區缺鉀土壤中分離一些硅酸鹽細菌，并對其中具有較高解鉀能力的菌株進行分類鑒定，可為利用硅酸鹽細菌增加重慶植煙區缺鉀土壤中有效鉀的含量提供微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品采自重慶市彭水縣植煙區。風干，過1 mm篩備用。

鉀長石粉：經0.1 mol/L NH4Cl溶液清洗，陰干備用[7]。

白云母粉：過1 mm篩，陰干備用。

1.2 培養基

缺鉀培養基A：蔗糖5.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO3 1.0 g， Na2HPO4 2.0 g，FeCl3 0.005 g，鉀長石粉 1.0 g，去離子水1 L[8]。

缺鉀培養基B：蔗糖5.0 g，Na2HPO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，鉀長石粉或白云母粉1.0 g，FeCl3 溶液數滴，去離子水 1 L，瓊脂 20 g[9]。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏 4.0 g，蛋白胨 10.0 g，去離子水1 L，pH 7.2～7.5。

無氮培養基：蔗糖 10.0 g，K2HPO2 2.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4 0.5 g， CaCO3 0.5 g， 酵母膏 0.5 g，去離子水1 L，瓊脂 15.0 g，pH 7.4[10]。

1.3 方法

1.3.1 解鉀菌篩選與培養

1）土壤樣品稀釋。在無菌操作下稱取10.0 g土壤樣品，加入到含玻璃珠及90 mL無菌水的三角瓶中。置于搖床以200 r/min充分振蕩30 min，即配制成10-1土壤稀釋液。用無菌槍頭吸取5.0 mL上述稀釋液，加入到含45 mL無菌水的三角瓶中，混勻成10-2土壤稀釋液。這樣依次稀釋，得到10-3土壤稀釋液（每個稀釋度須更換無菌槍頭）。

2）推板篩選。選取10-2以及10-3稀釋度的土壤稀釋液，分別吸取200 ？滋L加入到缺鉀培養基A中，進行平板涂抹，涂抹均勻后30 ℃培養3 d左右。挑取邊緣整齊、濕潤、黏稠、無色透明、富有彈性的菌落[10]，劃線純化。

挑取純化后的單菌落加入牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30 ℃，160 r/min搖瓶擴大培養，分裝添加適量甘油后低溫保存。

1.3.2 解鉀能力的測定 每250 mL三角瓶中加50 mL缺鉀培養基B，添加不同類型的礦物（鉀長石粉、白云母粉），121 ℃，20 min滅菌。加入3 mL菌懸液（OD600nm=1.0），分別設置20、25、30、35 ℃ 4個溫度梯度， 3次重復，160 r/min搖床培養。培養6 d后取培養液用60 g/L稀H2O2消煮，過濾定容。采用火焰光度法測定速效鉀的含量[11]。

1.3.3 細菌鑒定 根據解鉀能力測定結果，選取解鉀能力較好的細菌進行DNA序列擴增。采用細菌16～23S rDNA通用引物 16～23S（1）（5′- TTGT

ACACACCGCCCGTC-3′）， 16～23S（2）（5′-CCTTTCC

CTCACGGTACTG-3′），配置25 μL PCR反應體系：包括1×PCR緩沖液，0.625 U Taq酶，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs， 0.4 μmol/L primer1， 0.4 μmol/L primer2，50～100ng /μL DNA模板稀釋液。PCR擴增程序為95 ℃預變性10 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，32個循環；72 ℃延伸5 min。取10 μL PCR擴增產物，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物割膠回收，經TA克隆后送至英濰捷基（上海）貿易有限公司進行測序。

1.3.4 生理生化特性測定 采用革蘭氏染色法，并以無氮培養基為基礎，進行葡萄糖、明膠等生理生化特性測定和一些生物學特性測定，具體方法參見《常見細菌系統鑒定手冊》[12]。

2 結果與分析

2.1 解鉀菌篩選結果

經過土壤樣品稀釋涂平板，在分離培養基的平板上可觀察到圓形、表面光滑且透明、凸起、有彈性的菌落，培養3～5 d后菌落直徑約為7～9 mm。由于多數的解鉀菌在具有解鉀能力的同時具有固氮能力，所以在菌株的選擇上，以能否產莢膜作為一個篩選條件 [4] 。挑取符合上述形態的菌株在無氮培養基上進行劃線純化，然后通過莢膜染色，選擇有莢膜的菌株，分別命名為K1～K8。

2.2 解鉀菌K1～K8對鉀長石和白云母的解鉀作用

將解鉀細菌k1～k8接種于缺鉀液體培養基B（分別含鉀長石和白云母），分別置于20、25、30、35 ℃搖瓶培養，培養6 d，測定其速效鉀的含量，結果見圖1和圖2。由圖1可知，K2與其他菌株相比，在20、30 ℃條件下解鉀能力最強，速效鉀的含量分別比對照增加了近80%和100%，且K2在20 ℃條件下解鉀能力強于其他溫度。由圖2可知，在20 ℃條件下K6解鉀能力強于其他溫度，且其在20、30、35 ℃條件下的解鉀能力強于其他菌株，速效鉀的含量分別比對照增加了133%、100%、125%。同時，由圖2可知，K2在25 ℃條件下對白云母粉的解鉀能力強于其他溫度，這與圖1中K2對鉀長石粉的解鉀能力隨溫度的變化不同。圖1與圖2相比較可知，細菌K1～K8對白云母粉的解鉀能力均高于對鉀長石粉的解鉀能力。

2.3 解鉀細菌的分子生物學鑒定及生理生化特性

2.3.1 菌株K2和K6的鑒定結果 對解鉀能力較強的細菌K2和K6進行分子生物學鑒定。PCR擴增結果表明，K2擴增出長約1 000 bp DNA片段，K6擴增出長約900 bp DNA片段（圖3）。將測序結果與NCBI數據庫中已報道的菌種進行BLAST比對，結果顯示K2與短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis NBRC 100599 DHA）（登錄號：AP008955.1）相似度達99%，K6與膠質類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus K02）（登錄號：CP003422.1）相似度達99%。可據此判定K2屬于短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis），K6屬于膠質類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus）。

2.3.2 生理生化特性 K2生理生化特性符合短芽孢桿菌屬（Brevibacillus Shida）的特性，K6的生理生化特性也符合芽孢桿菌屬（Bacillus Cohn）的特性（表1），即從生理生化的角度對分子生物學鑒定結果進行了驗證。

3 討論

近年來，硅酸鹽細菌在農業生產中潛在的應用前景逐漸為人們所了解，并將應用到微生物肥料中，表明硅酸鹽細菌具有良好的發展前景。

蔣先軍等[13]認為，硅酸鹽細菌的增產作用不應只從它能分解硅酸鹽礦物釋放出鉀來考慮，還應考慮到硅酸鹽細菌作為一種根際微生物在植物微生物系統中的作用及自身產生的各種作用，如影響植物營養的有效吸收和植物病原物的活動，以及代謝產物對植株生長的影響等。同時，王思遠[14]研究表明，硅酸鹽細菌能明顯地促進土壤養分的轉化，促進煙株對養分的吸收利用和生長發育，配合一定量的氮、磷、鉀化肥施用效果更好，能明顯地促進煙株的生長發育。盛下放等[15]研究表明，硅酸鹽菌劑不僅可以促進棉花生長，提高其產量和品質，而且可以降低生產成本，保護生態環境。因此，從生態角度上，開發以具有解鉀能力的細菌為主要成分的生物鉀肥應用前景廣闊。

本試驗通過對8株細菌進行解鉀能力的測定，發現有兩株細菌的解鉀能力較好。但是， K2細菌25 ℃條件下對鉀長石粉的解鉀作用不及20 ℃和30 ℃，這是本試驗存在的一個重要問題，可能是由于消煮不徹底，導致很大的誤差產生。

同時，本試驗證實了8株細菌對白云母的釋鉀能力均高于鉀長石，這可能與礦物結構有關，鉀長石是架狀結構的硅酸鹽礦物，而白云母則是層狀結構的硅酸鹽礦物，細菌較易于從云母類礦物中獲得速效鉀。連賓等[16]研究表明，對架狀結構的硅酸鹽礦物而言，硅酸鹽細菌主要通過形成細菌-礦物復合體并由此產生細菌對礦物表面的溶蝕作用，隨之礦物顆粒晶格逐漸發生變形或崩解，硅酸鹽細菌對礦物鉀的主動吸收作用，其代謝產物等化學因子對礦物顆粒有化學降解作用等幾種途徑來實施對礦物的解鉀作用，而對層狀結構的含鉀礦物而言，硅酸鹽細菌還可以通過擴大其層間的距離來促進其中鉀離子的釋放。這為進一步研究細菌與礦物作用的機理提供了理論依據。

何琳燕等[17]認為生物鉀肥功能的有效發揮必須滿足兩個基本條件：一是菌株的高效性，二是菌株本身對土壤環境的適應性。在將生物鉀肥施用在土壤中之前，必須保證該生物鉀肥有良好的解鉀能力。但是，盛下放等[18]研究發現，膠質類芽孢桿菌中有明顯的解鉀溶磷作用的只占15%～29%。因此，從我國豐富的膠質類芽孢桿菌資源中篩選出解鉀能力較強的膠質類芽孢桿菌具有重要的理論與實用價值。根據試驗結果，本研究中所篩選的短短芽孢桿菌和膠質類芽孢桿菌菌株有一定的解鉀能力，具備了制作生物鉀肥的前提條件，為進一步研究生物鉀肥對土壤環境的適應性打下了基礎。

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