利用正交試驗(yàn)優(yōu)化苦馬豆愈傷組織的誘導(dǎo)

郭剛

新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉 831100

利用正交試驗(yàn)優(yōu)化苦馬豆愈傷組織的誘導(dǎo)

郭剛

新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉 831100

本研究采用正交試驗(yàn)方法，以苦馬豆幼苗不同部位為外植體與較適愈傷組織誘導(dǎo)激素配比的篩選，探究不同外植體及激素組合對(duì)苦馬豆愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦馬豆幼苗子葉為較適外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA1.0mg/L+2,4-D0.50mg/L激素配比為較適配方，為苦馬豆組培工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。

苦馬豆；外植體；愈傷組織；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

苦馬豆[Swainsonasalsula（Pall.)DC]隸屬豆科苦馬豆屬植物，別名羊尿泡，屬多年生草本或小喬木[1]。以全草、根、果實(shí)入藥，具有利尿、消腫、降壓等功效，主要分布于中亞及我國西北地區(qū)，我國僅有一屬一種[2～4]。

苦馬豆的次生代謝產(chǎn)物—苦馬豆素,具有抗腫瘤、抗AIDS病毒和增強(qiáng)肌體免疫力的活性[5～6]，有可能成為一種很有前途的腫瘤治療輔助藥物,因而備受關(guān)注。西北農(nóng)林科大博士生導(dǎo)師曹光榮教授認(rèn)為苦馬豆素最大的優(yōu)勢在于，在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)人體免疫系統(tǒng)具有保護(hù)作用，毒副作用極其微弱。同時(shí)，苦馬豆素用于抑制腫瘤將使珍稀瀕危藥材——紫杉醇有了來源廣泛的替代品[7]。

近年，過度放牧、過度農(nóng)墾和不合理采集地下水資源等原因?qū)е峦恋厣衬鷳B(tài)環(huán)境日益惡化，植被遭到破壞，而且采集和消耗苦馬豆的數(shù)量已經(jīng)超過野生苦馬豆資源的再生能力，野生苦馬豆資源數(shù)量急劇下降，日趨匱乏。目前，前人對(duì)其無性再生研究已有報(bào)道，但對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)體系優(yōu)化篩選的文獻(xiàn)未見有詳細(xì)報(bào)道，筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，研究意義：一是利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)一步探討不同外植體及激素配比對(duì)苦馬豆愈傷組織誘導(dǎo)的影響，篩選較有利于愈傷組織誘導(dǎo)的外植體及培養(yǎng)基激素配比，以建立并優(yōu)化苦馬豆愈傷組織誘導(dǎo)體系；二是，已報(bào)道一些黃酮類成分已從該植物的全草中分離到，但從離體培養(yǎng)的愈傷組織中分離出有效藥用成分未見報(bào)道，故本試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)苦馬豆愈傷組織細(xì)胞的離體培養(yǎng)和其代謝產(chǎn)物的研究有一定參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

苦馬豆種子（采集于新疆昌吉市二六工鎮(zhèn)），經(jīng)過浸泡處理，剝?nèi)シN皮，平鋪在墊濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在23℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，幼苗生長至5～6cm時(shí)，無菌處理，取上胚軸、下胚軸、子葉切段作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用MS為基本培養(yǎng)基，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)安排9次試驗(yàn)。試驗(yàn)因子及水平安排見表1，其中A為外植體，B為6-BA，C為2，4-D，D為光照。共9個(gè)處理，每處理接種10瓶，每瓶接種4塊外植體。接種后42d統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并進(jìn)行極差分析。

表1 L9(34)因子水平

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 無菌材料的獲得

無菌苗培養(yǎng)，挑選飽滿成心形的種子用濃硫酸浸泡20min，用自來水清洗，在超凈工作臺(tái)中紫外光殺菌15min，升汞消毒15min，無菌水沖洗5～6遍，75%酒精浸泡20s，再用無菌水沖洗4～5遍，接種在不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上，5d后長出幼苗。

1.3.2 外植體接種

無菌條件下將子葉和胚軸剪成1～2cm小段，分別接種在9個(gè)處理中，每個(gè)處理設(shè)10次重復(fù)，每瓶接種4個(gè)外植體，以探索不同種類、不同濃度激素對(duì)苦馬豆愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

1.3.3 外植體人工培養(yǎng)

將無菌接種的外植體分別培養(yǎng)于25±1℃，的光照培養(yǎng)室和人工暗培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度1500～2 000lx，光照時(shí)間14h/d。

1.3.4 觀察與記錄

每隔10d觀察、記錄1次。其中：愈傷組織誘導(dǎo)率=長愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

苦馬豆接種15d觀察到外植體切口處開始扭曲、腫脹，有愈傷組織萌動(dòng)的跡象；第18d腫脹明顯，表面呈疙瘩狀突起，并形成少量愈傷組織；第27d整個(gè)子葉愈傷化，并形成大量愈傷組織；第37d白綠色愈傷組織大量增殖，基本見不到原接種外植體。第37d調(diào)查的愈傷組織誘導(dǎo)率，L9 (34)正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表2得知，苦馬豆愈傷組織誘導(dǎo)各因素水平的最優(yōu)水平組合為A1B2C2D2。，即最適外值體為上胚軸，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/ L+2,4-D0.50mg/L，最佳光照為白光：由極差R值可看出，在該試驗(yàn)中B為主導(dǎo)因素，4個(gè)因子對(duì)苦馬豆愈傷組織誘導(dǎo)的影響程度依次為：6-BA＞2,4-D＞外植體＞光照。

3 結(jié)論與討論

3.1 愈傷組織的誘導(dǎo)與外植體的生理成熟度有關(guān)

外植體的選擇在理論上，任何具有生命力的植物的組織或器官都具有育成完整生物個(gè)體的潛在能力，都能作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，但研究表明，植物種類以及發(fā)育階段、年齡、生理狀態(tài)、外植體的大小、外植體在樹體和枝條上的位置、外植體的采集時(shí)間、季節(jié)等不同，其無性繁殖的能力也不一樣。同一種植物不同的組織和器官其再生能力也有很大差異[8]。

該試驗(yàn)以苦馬豆無菌幼苗上胚軸、下胚軸、子葉為外植體，試驗(yàn)結(jié)果表明，苦馬豆幼苗上胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，這與上胚軸自身含有部分天然生長激素有關(guān)。可見，愈傷組織的誘導(dǎo)與外植體的生理成熟度密切相關(guān)。

3.2 培養(yǎng)基激素配比

細(xì)胞分裂素和生長素的配比對(duì)苦馬豆愈傷組織誘導(dǎo)起著非常重要的作用，在該試驗(yàn)中，2個(gè)激素因子對(duì)苦馬豆愈傷組織誘導(dǎo)均產(chǎn)生影響，2，4-D對(duì)苦馬豆愈傷組織的誘導(dǎo)起到明顯的促進(jìn)作用。在苦馬豆愈傷組織的誘導(dǎo)中生長素與細(xì)胞分裂素最佳濃度配比為6-BA1.0mg/L+2，4-D0.50mg/L。

3.3 光照條件

同波長的光對(duì)器官脫分化和細(xì)胞分裂有影響，光質(zhì)通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶活性來調(diào)節(jié)糖分解的快慢，從而調(diào)節(jié)ATP、NADPH和其他合成代謝所需的小分子物質(zhì)的產(chǎn)生，以適應(yīng)生理需要[9]。該研究中，在白光光照條件下苦馬豆脫分化產(chǎn)生愈傷組織細(xì)胞較快且生長量較多，紅、藍(lán)光次之，暗培養(yǎng)對(duì)苦馬豆愈傷組織產(chǎn)生的作用最小。

本試驗(yàn)中藥用植物苦馬豆高效組織培養(yǎng)技術(shù)的建立為后續(xù)各種科技研究工作提供了相應(yīng)平臺(tái)，如利用現(xiàn)代生物技術(shù)離體懸浮培養(yǎng)苦馬豆愈傷組織，研究其代謝抗腫瘤新藥苦馬豆素的路徑和生理調(diào)控。

[1]馬金雙.關(guān)于苦馬豆屬學(xué)名的討論[J].云南植物研究，1991，13（4）:380-382.

[2]王進(jìn),王桔紅,張勇,等.苦豆子和苦馬豆種子特性及硬實(shí)破除研究[J].中藥材，2011，34（5）:670-673.

[3]周吉林,伍春蓮,陳衛(wèi)英.光照及黑暗條件下不同濃度2，4-D對(duì)誘導(dǎo)苦馬豆愈傷組織的影響[J].內(nèi)江師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，24（12）:41-44.

[4]崔小蓉,劉慧,楊軍.鈣鹽脅迫下苦馬豆愈傷組織生理指標(biāo)研究[J].西華師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2011，32（3）: 259-263.

[5]楊鳴琦.苦馬豆素對(duì)小白鼠移植性腫瘤S180，ARS的抑制試驗(yàn)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，1998，19（2）:26-29.

[6]吳達(dá)，梁冰，馮志剛，等.苦馬豆素研究進(jìn)展[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2003，22（2）:42～45.

[7]毛海峰.2003.當(dāng)代健康報(bào)[N].2003.7:17.

[8]薛春麗，郭俊明，李鐵梅.L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)白花蛇舌草愈傷組織誘導(dǎo)方案的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（21）：11122—11123.

[9]王亞麗，王曉東，趙兵，等.光質(zhì)對(duì)瑪咖愈傷組織生長、分化的影響[J].過程工程學(xué)報(bào)，2007，7（4）：782-785.

郭剛（1977年—），講師，碩士，研究方向?yàn)橹参锟鼓嫔砼c藥用植物組培。

新疆自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011211A087）。

2014-02-27