雙氫青蒿素聯合順鉑對荷瘤大鼠的免疫功能的影響

裴曄 李娟 史小榮

摘要：

目的：研究不同劑量的雙氫青蒿素聯合順鉑對荷瘤大鼠的免疫抑制作用的影響。方法：1.將低分化上皮性卵巢癌細胞株NUTU-19注入F344大鼠的右腋皮下，建立人卵巢癌移植瘤的動物模型。2.將建模成功的40只F344大鼠分隨機為5組，即順鉑對照組、空白對照組、順鉑+雙氫青蒿素高劑量組、順鉑+雙氫青蒿素中劑量組、順鉑+雙氫青蒿素低劑量組。觀察干預后各組移植瘤抑瘤率，取出瘤體，進行腫瘤形態學觀察，顯微鏡下進行組織病理學檢測。無菌取脾，測T/B淋巴細胞轉化功能的測定，用ELISA方法檢測大鼠血清IL-2及IFN-γ變化情況。結果：1.順鉑+雙氫青蒿素各組抑瘤率與順鉑組相比升高顯著，差異有統計學意義（P<0.001）。2.移植瘤組織病理學監測：瘤細胞的體積較大，胞質疏松，核深染，有不同程度的核固縮、核碎裂及核溶解，細胞中可見局灶性壞死。3.順鉑+雙氫青蒿素高劑量組大鼠T/B淋巴細胞轉化率、血清IL-2及IFN-γ明顯高于順鉑組（P0.001）。結論：（1）DHA聯合順鉑對荷瘤大鼠卵巢癌皮下移植瘤的生長有抑制作用，其聯合作用功效強于單用順鉑，增強了順鉑的敏感性。（2）DHA聯合順鉑對荷瘤大鼠機體免疫功能有增強作用，通過提高荷瘤大鼠脾淋巴細胞轉化功能及血清IL-2和IFN-γ的水平，可能降低患者卵巢癌復發和淋巴結轉移的風險。

關鍵詞：雙氫青蒿素；卵巢癌；大鼠；順鉑；淋巴細胞轉化率；IL-2 IFN-γ

【中圖分類號】

R711.75 【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）05-0004-02

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一，因其早期診斷困難，且死亡率居婦科惡性腫瘤首位，成為直接威脅著婦女生命健康的疾病之一。雖然經典的卵巢癌細胞減滅術和化療水平不斷改進，但晚期卵巢癌五年存活率仍未明顯升高。隨著免疫生物學、分子生物學和腫瘤免疫學的深入研究，為腫瘤的免疫治療提供了新的思路。本實驗旨在研究青蒿素及其衍生物抗腫瘤作用，嘗試將順鉑與其聯合使用，探討使用青蒿素后荷瘤大鼠免疫狀態的改變，試圖尋找青蒿素降低復發風險，改變其轉歸的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料：

低分化上皮性卵巢癌細胞株NUTU-19，購自上海橋杜商貿有限公司細胞中心；F344大鼠40只， 8-9周齡，雌性，體重140～150g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，飼養于山西醫科大學寄生蟲實驗動物房。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養細胞操作過程 將卵巢癌細胞株NUTU-19，復蘇后移至培養瓶中，加入培養基，放于培養箱中（37℃，5%CO2），在細胞的對數生長期進行計數。

1.2.2 動物模型建立 建立F344大鼠卵巢癌動物模型，共40只。調整卵巢癌細胞株NUTU-19細胞懸液濃度為4x107/ml，于每只大鼠右腋皮下注射0.2ml細胞懸液，觀察移植瘤生長情況。

1.2.3 實驗分組及給藥方法

接種后第10天每只大鼠右腋長有約0.4*0.4cm腫瘤，將荷瘤大鼠隨機分為5組，每組8只。各組大鼠同時治療，如下：

（1）空白對照組：每只腹腔注射生理鹽水2ml，隔天一次。

（2）順鉑組：每只腹腔注射順鉑3mg/kg，隔天一次。

（3）DHA高劑量+順鉑組：DHA400mg/kg +順鉑3mg/kg腹腔注射，隔天一次。

（4）DHA中劑量+順鉑組：DHA300mg/kg +順鉑3mg/kg腹腔注射，隔天一次。

（5）DHA低劑量+順鉑組：DHA200mg/kg +順鉑3mg/kg腹腔注射，隔天一次。

1.2.4 測定抑瘤率：給藥5次后禁食，第二天乙醚麻醉處死大鼠，迅速摘取瘤體，稱重并記錄。抑瘤率（%）=（空白荷瘤組平均瘤重-各實驗組平均瘤重）/空白荷瘤組平均瘤重×100%2.5脾淋巴細胞轉化率的測定 乙醚麻醉處死大鼠，無菌取大鼠脾臟，剪碎、研磨，200目篩過濾，制備為單個細胞懸液，加入10ml的NH4Cl于37℃水浴10分鐘裂解紅細胞，調整細胞濃度為2×106/ml，制成脾淋巴細胞懸液。用MTT法測定脾淋巴細胞轉化率，用酶標儀在490nm波長處測定光密度（OD）值，以SI（刺激指數）值高低反映脾淋巴細胞轉化率的高低，SI計算公式：SI=PHA刺激孔OD平均值/細胞對照孔OD平均值。

1.2.6 檢測大鼠血清IL-2和IFN-γ的濃度 按照上述ELisa試劑盒說明書操作。

1.3 統計學方法： 統計數據X±s表示，所有實驗數據均采用SPSSl3.5軟件進行統計學分析，行單因素方差分析及組問比較最小顯著差（1east significant difference，LSD）法。以=0.05為檢驗水準，P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 順鉑+雙氫青蒿素對大鼠腫瘤生長的作用：

順鉑+雙氫青蒿素高劑量組、中劑量組和低計量組對卵巢腫瘤抑制率分別為30.26%、47.32%及62.13%，順鉑組抑瘤率28.14%，順鉑+雙氫青蒿素各組、順鉑組與空白對照組比較差異有統計學意義（P<0.001）。順鉑+雙氫青蒿素各組抑瘤率與順鉑組相比，高劑量雙氫青蒿素組抑瘤率最高，差異有統計學意義（P<0.001）。

2.2 移植瘤組織病理學檢測：

接種10天后，每只大鼠右側腋下接種處均長出一瘤結節，大小約0.4*0.4cm。呈球形，質硬，活動尚可，表明皮膚血管豐富。各組干預后處死大鼠取瘤體制片，鏡下觀察：瘤細胞的體積較大，胞質疏松，核深染，有不同程度的核固縮、核碎裂及核溶解，細胞中可見局灶性壞死。

2.3 雙氫青蒿素對大鼠的免疫功能的影響：

2.3.1 實驗各組大鼠T/B淋巴細胞轉化率的變化： 實驗各組大鼠T/B淋巴細胞轉化率見表1。同空白組比較，順鉑+雙氫青蒿素高劑量組、中劑量組和低劑量組大鼠T/B淋巴細胞轉化率均升高，差異有顯著統計學意義（P<0.001）。順鉑+雙氫青蒿素高劑量組大鼠T/B淋巴細胞轉化率明顯高于順鉑組，且有統計學差異（P<0.001）。如表-1。

3.2 各組大鼠血清IL-2及IFN-γ水平變化。同空白對照組相比，順鉑治療組大鼠血清IL-2及IFN-γ水平均有所下降（P<0.001）。順鉑+青蒿素中劑量組和低劑量組血清IL-2及IFN-γ水平與順鉑組比較差異無統計學意義（P>0.05）；順鉑+青蒿素高劑量組與順鉑組比較有統計學意義（P<0.001）。如表-2、表-3。

3 討論

卵巢癌是一種常見的惡性腫瘤，威脅婦女的生命健康，近年來雖然在治療方面有了一定的進展，但是耐藥性的出現，

腫瘤的短期復發、轉移使得患者五年存活率仍舊沒有明顯改善，故尋找新的抗腫瘤治療途徑成為現今的研究熱點。

3.1 雙氫青蒿素抗腫瘤的作用：

在不斷研制新藥的同時，老藥新用也是研究抗腫瘤藥物的一個途徑。1991年，我國學者鄧有安等^[1]首次報道了青蒿素衍生物能有選擇性殺傷活白血病P388細胞。隨后孫瑋辰等^[2]研究人員發現青蒿素能殺傷具有增生分裂能力的腫瘤干細胞。美國華盛頓大學的Lai研究員^[3]及Singh副研究員^[4]也先后研究發現，加入全轉鐵蛋白，DHA對培養的人白血病淋巴細胞的具有很強殺傷作用，而比對正常人淋巴細胞的不敏感。此后的研究發現，青蒿素對肝癌、胃癌、前列腺癌、結腸癌、宮頸癌等多種腫瘤均具有抗癌活性，且作用廣泛。青蒿素還可以通過抑制腫瘤新生血管形成、與Fe²⁺作用的細胞毒作用、抑制端粒酶活性以及損傷細胞線粒體等多種作用機制而實現抗腫瘤作用^[6-10]。經病理組織觀察發現，青蒿素各干預組卵巢腫瘤細胞凋亡、壞死程度明顯升高，從而發揮了其抑制腫瘤生長的作用，增加了順鉑化療的敏感性。

2 雙氫青蒿素對卵巢惡性腫瘤的免疫調節作用

2.1 雙氫青蒿素對免疫細胞的影響：

免疫細胞包括淋巴細胞和輔助細胞兩大類。研究表明DHA能抑制B淋巴細胞分裂增殖，促進CD4T細胞和CD8T細胞的分裂增殖；并且減少B細胞分泌抗體，減輕體液免疫反應，免疫復合物生成減少^[16]；青蒿素等通過活化Ts細胞，抑制體液免疫，Ts細胞增多會進一步降低抗體水平^[12-15]。本實驗中高劑量組青蒿素聯合順鉑治療卵巢癌荷瘤大鼠后其體內T/B淋巴細胞轉化率明顯上升，表明青蒿素可能通過增強T淋巴細胞的免疫反應從而增強其抑制腫瘤生長的作用。

2.2 雙氫青蒿素對免疫因子的影響：

免疫細胞及其分泌的免疫因子在腫瘤的發病中發揮了重要的作用。活化淋巴細胞及巨噬細胞分泌的許多細胞因子，如TNF-γ等，因其能專一殺傷腫瘤細胞而無礙于正常細胞而日趨受到人們的重視。譚先杰等^[17]的研究結論為DHA能制卵巢癌細胞的體外增殖，該作用可能與其下調癌細胞內ERK 1/2的磷酸化水平有關。董妍君等人^[18-19]還進一步深入探討了DHA治療LA的免疫分子機理，主要是通過調節免疫活性物質產生起作用，包括IL-1、6，腫瘤壞死因子等免疫因子的表達。IL-2是新近發現的具有潛在抗腫瘤作用的免疫調節性因子，是由輔助性T細胞產生的，具有促進T細胞增殖，誘導Lak細胞促進B細胞分泌抗體，促進T細胞殺傷作用以及增強NK細胞活性等作用^[20]。我們的實驗結果中IL-2、IFN-γ在青蒿素高劑量聯合順鉑組明顯高于其他各組，根據結果推斷青蒿素聯合順鉑治療卵巢癌不僅抑制了腫瘤的生長，而且通過改變機體免疫狀態，增加細胞因子水平對，從而對其預后進行了改善，降低了患者復發和淋巴結轉移的風險。該實驗結果為我們今后卵巢癌提供了嶄新的治療途徑，為腫瘤免疫治療提供了理論基礎。

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