血漿RNF180啟動子甲基化及其蛋白表達在胃癌診斷中的價值*

張學(xué)松 張 謝 孫蓓蕾 宋毓飛 陸宏娜 王丹萍 黃志剛

·臨床研究與應(yīng)用·

血漿RNF180啟動子甲基化及其蛋白表達在胃癌診斷中的價值*

張學(xué)松 張 謝 孫蓓蕾 宋毓飛 陸宏娜 王丹萍 黃志剛

目的：探討血漿RNF180基因啟動子甲基化及其蛋白表達在胃癌臨床診斷中的價值。方法：采用甲基化特異性PCR法（MSP）和ELISA法檢測各組患者血漿中RNF180甲基化狀態(tài)和RNF180蛋白表達情況，并分別將其與各臨床病理指標(biāo)進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果：MSP結(jié)果顯示胃癌患者血漿中RNF180基因啟動子甲基化率為62.75%，健康者為21.88%，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。RNF180甲基化陽性率與腫瘤大小、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05）。ELISA結(jié)果顯示胃癌血漿RNF180蛋白水平（23.22±1.36）μg/mL明顯低于對照健康組（34.25±2.44）μg/mL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。胃癌血漿RNF180蛋白表達水平與臨床病理特征無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：胃癌患者血漿RNF180基因表達存在高甲基化率，而RNF180蛋白表達明顯下降，提示血漿RNF180基因甲基化可作為一種微創(chuàng)的檢測方法在臨床胃癌診斷中有潛在的應(yīng)用價值。

RNF180基因 甲基化 胃癌 血漿 甲基化特異性PCR

胃癌是國內(nèi)最常見惡性腫瘤之一，死亡率居高不下，是一種嚴(yán)重威脅人民身體健康的疾病［1-2］。10年前，Shapir等［3］發(fā)現(xiàn)在消化道惡性腫瘤患者的血清中，游離DNA含量明顯高于良性病變患者。近年來研究發(fā)現(xiàn)血漿游離DNA的異常甲基化是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中重要的基因?qū)W改變［4-6］。DNA甲基化的改變可通過影響癌基因和抑癌基因的表達而參與癌的發(fā)生。這為通過檢測血漿DNA甲基化狀態(tài)來進行胃癌早期篩查提供了可能。

環(huán)指蛋白RNF180是最新發(fā)現(xiàn)的一個受DNA甲基化調(diào)控的抑癌基因［7-8］。本研究應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（metIlylation specific PCR，MSP）法及酶聯(lián)免疫吸附實驗法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測胃癌血漿RNF180 DNA啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)和蛋白表達水平。結(jié)合臨床病理學(xué)特征、患者一般資料來探討血漿RNFl80基因甲基化在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，以期為胃癌早期診斷、以及胃癌普查提供一個新的腫瘤標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集浙江省寧波市李惠利醫(yī)院2012年7月至2013年7月胃小腸外科收治的51例胃癌患者的血漿標(biāo)本。入選條件：1）患者均經(jīng)過胃鏡活檢確診；2）患者未經(jīng)任何放、化療治療；3）無其他腫瘤病史。男性33例，女性18例；年齡34～83歲，中位年齡60歲。全部病例均按WHO標(biāo)準(zhǔn)和國際抗癌聯(lián)盟TNM系統(tǒng)進行臨床分期和組織病理分型。另收集32例正常健康者（體檢無殊）的血漿標(biāo)本作為對照，男性16例，女性16例，年齡42～80歲，中位年齡60歲。于患者手術(shù)前采集其周圍靜脈血液標(biāo)本3 mL，置于乙二胺四乙酸鈉處理過的抗凝管中，3 000 r/min離心15 min，離心取上清，置于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 ELISA實驗 取上述血漿標(biāo)本，按RNF180 ELISA檢測試劑盒購自上海研輝公司，按說明書進行蛋白測定。每個樣品做復(fù)孔，取平均值。根據(jù)ROC曲線，以RNF180＞27.53 μg/mL判斷為陽性結(jié)果。

1.2.2 DNA提取 取上述采樣血漿標(biāo)本，每份樣本取400 μL血漿，按QIAmp DNA Blood Mini Kit（Qiagen，Germany，51104）試劑盒說明書進行DNA提取，最終以80 μL AE洗脫液洗脫，存于-20℃冰箱備用。1.2.3 DNA修飾 每個樣品取2 μg DNA，按照Epi-Tect Bisulfite Kit說明書進行。經(jīng)亞硫酸鹽處理后DNA中未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變成尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶則保持不變，修飾后的DNA用30 μL EB重新溶解，可用于MSP檢測。

1.2.4 MSP檢測 設(shè)計MSP引物，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL：2 μL DNA樣品，10 μL緩沖液（KAPA BIO，United States），1 μL 10 mmol/L dNTP（KAPA BIO，United States），1 μ上下引物（l50 mmol/L），0.5 U Taq酶（KAPA BIO，United States）。

擴增條件：第一步，95℃預(yù)變性5 min；第二步，95℃變性30 s，Tm-0.8℃退火30 s，72℃延伸1 min，共10個循環(huán)；第三步，95℃變性30 s，Tm℃退火30 s，72℃延伸1 min，共38個循環(huán)；最后，72℃延伸7 min

PCR擴增結(jié)束后，產(chǎn)物于2.5%瓊脂糖凝膠（含溴化乙啶0.5 μg/mL）鑒定，每孔加樣量為10 μL，電泳緩沖液為1×TAE。電泳結(jié)束后，紫外檢測儀下觀察并拍照。甲基化判定：PCR產(chǎn)物出現(xiàn)甲基化條帶，而不出現(xiàn)非甲基化條帶的樣品，判定為基因甲基化；出現(xiàn)未甲基化條帶，而不出現(xiàn)甲基化條帶的樣品，判定為基因未甲基化；甲基化條帶和未甲基化條帶均出現(xiàn)的樣品，判定為基因甲基化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS l3.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。各組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料的陽性率比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿RNF180基因甲基化表達

MSP結(jié)果顯示胃癌患者與正常健康者血漿標(biāo)本RNF180基因啟動子甲基化發(fā)生率分別為62.75%（32/51），21.88%（7/32）。兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖1，2）。

2.2 胃癌患者血漿RNF180基因甲基化與臨床病理特征相關(guān)性

胃癌患者血漿RNF180甲基化發(fā)生率與性別、年齡無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性（均P＞0.05，表1）。RNF180甲基化陽性率與腫瘤大小、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（均P＜0.05，表2）。

圖1 正常健康者與胃癌患者血漿RNF180基因MSP電泳圖Figure 1 MSP electrophoretograms of aberrant RNF180 methylation in gastric cancer patients and healthy controls

表1 RNF180 MSP甲基化引物序列Table 1 Primer sequences of RNF180 in MSP

表2 胃癌患者血漿RNF180基因甲基化率與其臨床病理特征相關(guān)性Table 2 Correlation of RNF180 methylation with clinicopathological features in plasma samples of gastric cancer patients

2.3 血漿RNF180蛋白表達

ELISA結(jié)果顯示胃癌血漿RNF180蛋白水平為（23.22±1.36）μg/mL，明顯低于對照健康組（34.25± 2.44 μg/mL），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖3）。根據(jù)ROC曲線，以RNF180＞27.53μg/mL判斷為陽性結(jié)果。結(jié)果顯示胃癌血漿RNF180蛋白表達陽性率為31.37%（16/51），正常健康者陽性率為91.30%（21/ 32），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 胃癌患者血漿RNF180蛋白表達與臨床病理特征相關(guān)性

胃癌血漿RNF180蛋白表達水平與性別、年齡與腫瘤大小、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移均無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)（均P＞0.05，表3）。

?圖2 正常和胃癌患者血漿RNF180甲基化發(fā)生率（P＜0.01）Figure 2 Frequency of detecting methylated RNF180 DNA in the plasma of patients with gastric cancer and normal controls(P＜0.01)

?圖3 正常健康者和胃癌患者血漿RNF180蛋白水平表達Figure 3 ELISA results of RNF180 protein levels in patients with gastric cancer and the controls subjects

表3 胃癌患者血漿RNF180蛋白表達與臨床病理特征相關(guān)性Table 3 Correlation of RNF180 protein levels in plasma samples of gastric cancer patients with chinicopathologic features

3 討論

表型遺傳基因沉默已被認(rèn)為在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用，基因啟動子甲基化導(dǎo)致異常基因沉默乃至腫瘤發(fā)生［9-12］。胃癌中諸多基因存在高甲基化現(xiàn)象，基因啟動子甲基化常發(fā)生在胃癌癌變過程的極早期［13-15］。環(huán)指蛋白RNF180是一個膜結(jié)合的E3泛素連接酶，包含RING finger和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，參與了細(xì)胞內(nèi)許多重要生理的過程，包括細(xì)胞增殖、分化，以及腫瘤形成［8-9］。Cheung等［8］研究發(fā)現(xiàn)RNF180 mRNA以及蛋白表達在胃癌細(xì)胞株中下調(diào)或消失，且在胃癌組織中表達也明顯下降，暗示RNF180可能是一個新的胃癌特異性腫瘤抑制因子。研究還發(fā)現(xiàn)胃癌血漿RNF180甲基化表達率為56%（18/32），但是在64例正常患者中未檢測到甲基化，說明RNF180基因是受DNA甲基化調(diào)控的新的抑癌基因，為RNF180基因DNA的甲基化作為胃癌非侵入性篩查手段提供了可能。

目前國內(nèi)外尚鮮見研究血漿RNF180甲基化及蛋白表達水平與胃癌患者臨床資料，如性別、年齡、以及患者病理特征，腫瘤大小、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示胃癌患者血漿RNF180甲基化率顯著高于正常健康者（P=0.001）。提示胃癌患者血漿中RNF180基因甲基化的升高可能是其基因失活而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要原因。

為了進一步驗證，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測胃癌血漿RNF180表達，研究發(fā)現(xiàn)胃癌血漿中的RNF180蛋白量表達顯著低于正常健康者（P＜0.001），提示甲基化可能是導(dǎo)致RNF180基因蛋白表達下調(diào)的主要原因。研究還發(fā)現(xiàn)在胃癌血漿中RNF180甲基化水平與胃癌臨床分期、組織分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。從而推測RNF180基因啟動子甲基化在胃癌的分化、增殖及腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移中起重要作用。本研究結(jié)果顯示RNF180蛋白表達水平與胃癌臨床分期、組織分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移無關(guān)，與甲基化水平的臨床病理學(xué)特征存在不一致現(xiàn)象。這原因可能是除了甲基化外，RNF180還可通過組蛋白去乙酰化、基因突變、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等機制影響基因表達［8］。

綜上所述，從基因甲基化尋找特異性的腫瘤標(biāo)志物，對于胃癌早期診斷有著積極的意義。本研究結(jié)果表明，利用MSP進行的血漿標(biāo)本RNF180基因甲基化分析，作為一種微創(chuàng)的檢測方法在臨床診斷中有潛在的應(yīng)用價值，有可能成為一種新的輔助胃癌診斷的分子生物學(xué)指標(biāo)。本研究收集的樣本較少，接下來我們將收集更多的胃癌標(biāo)本，進一步進行驗證。本實驗進行MSP檢測用的是定量方法，接下來會根據(jù)前期得到是實驗結(jié)果，對RNF180進行焦磷酸測序，進一步驗證RNF180作為胃癌非侵入性早期篩查的可行性和可信性。

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（2014-06-24收稿）

（2014-09-25修回）

（本文編輯：賈樹明）

張學(xué)松 專業(yè)方向為胃腸道腫瘤診斷與內(nèi)鏡下治療。

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Diagnostic value of promoter methylation and protein expression of plasma RNF180 gene in gastric cancer

Xuesong ZHANG,Xie ZHANG,Beilei SUN,Yufei SONG,Hongna LU,Danping WANG,Zhigang HUANG

Zhigang HUANG;E-mail:huangzg@foxmail.com
Department of Gastroenterology,Ningbo Medical Center,Li Huili Hospital,Ningbo 315040,China
This work was supported by the Municipal Natural Science Foundation of Ningbo(No.2012A610212)and the Scientific Innovation Team Project of Ningbo(No.2013B82010)

Objective:To investigate the diagnostic value of the promoter methylation of plasma RNF180 gene and its protein expression for the detection of gastric cancer.Methods:Methylation-specific polymerase-chain reaction(MSP)and enzyme-linked immuno-sorbent assay(ELISA)were performed to detect DNA methylation and protein expression of the RNF180 gene,respectively.The correlations of DNAmethylation and protein expression of the RNF180 gene with the clinico-pathological parameters of gastric carcinoma were then separately analyzed.Results:MSP showed that the methylation rates of the RNF180 gene were 62.75%and 21.88%in the plasma of patients with gastric carcinoma and healthy volunteers,respectively;this result indicated that the two groups significantly differed(P＜0.01).The methylation of the RNF180 gene was associated with tumor size,clinical stage,tumor differentiation,lymph node metastasis,and distant metastasis(P＜0.05).ELISA results showed that the protein expression of the RNF180 gene[(23.22±1.36) μg/mL]was significantly lower(P＜0.01)in the plasma of patients with gastric carcinoma than in the plasma of healthy volunteers [(34.25±2.44)μg/mL].However,the protein expression of the RNF180 gene was not associated with clinicopathological parameters (P＞0.05).Conclusion:The RNF180 gene is expressed at a hypermethylation rate,and the corresponding protein expression level is decreased in the plasma of individuals with gastric carcinoma.Therefore,RNF180 gene methylation in plasma could be applied to detect microinvasion for the clinical diagnosis of gastric cancer.

RNF180 gene,methylation,gastric cancer,plasma,methylation-specific polymerase-chain reaction

10.3969/j.issn.1000-8179.20141067

寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院消化內(nèi)科（浙江省寧波市315040）

*本文課題受寧波市自然基金項目（編號：2012A610212）和寧波市科技創(chuàng)新團隊項目（編號：2013B82010）資助

黃志剛 huangzg@foxmail.com