大孔樹脂法提取抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性物質的工藝研究

劉紅，江娟，張心蕊，陳海芹，胥秀英

(重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054)

大孔樹脂法提取抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性物質的工藝研究

劉紅，江娟，張心蕊，陳海芹，胥秀英

(重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054)

為了優化大孔樹脂提取1012-4菌株發酵液中抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性物質的工藝，通過多種型號比較，確定大孔樹脂型號，然后基于單因素實驗探討最優工藝。實驗結果表明:最優樹脂型號為NKA-2，其吸附量為5%;洗脫溶劑及濃度為15%的乙醇溶液，洗脫體積為6 BV，吸附流速為2 mL/min，解吸附流速為1 mL/min。該方法環保、節能，可操作性強，可用于工業化生產。

大孔樹脂;耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;提取;工藝

自1961年Jevons首次發現耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)以來，由于其廣泛的耐藥性和抗生素的濫用，MRSA以驚人的速度在世界范圍內蔓延，至今其感染幾乎遍及全球，已成為院內感染的重要病原菌之一［1］。目前臨床上常見的MRSA治療藥物有萬古霉素、去甲基萬古霉素、達托霉素、利奈唑胺等，但均具有一定的副作用［2］。因此，當務之急是尋求更加安全、有效、穩定、可控的治療MRSA感染藥物。隨著生物技術的快速發展，越來越多的研究發現，從微生物來源篩選抗MRSA菌株具有廣闊的開發前景，諸如萬古霉素、達托霉素就是通過微生物發酵而來。本研究從自然來源分離菌株，經鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，能發酵產生一種抑制MRSA生長的物質，具有很好的研究價值。

大孔吸附樹脂提取技術是近些年發展起來的一種新型提取技術，是一種對環境友好的、高效的、新型的分離技術，能將目標產物進行富集，甚至達到一定精制的目的。采用大孔樹脂提取該類產品已有成功報道，如萬古霉素、去甲萬古霉素已通過該法制得［3］。本研究通過篩選不同型號的大孔樹脂以獲得最佳樹脂，并對樹脂提取參數進行優化，為相關的產品開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大孔樹脂型號:H103，D3520，D4020，D4006，AB-8，HZ806，NKA-2，NKA- 9;耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)由重慶第三軍醫大學附屬西南醫院臨床基地贈送;產抗MRSA菌株為本課題組于發酵食品中獲得。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵液預處理

將在4℃冰箱中保存備用的菌株，接種于LB斜面上，置于37℃隔水式恒溫培養箱中培養24 h;然后用滅菌的接種環接種于最適液體培養基中，再置于37℃恒溫振蕩培養箱(150 r/min)中培養24 h。此發酵液經8 000 r/min離心10 min收集上清液，再經0.22 μm過濾膜過濾除菌，即為待提取、分離純化活性物質的樣品。

1.2.2 樹脂型號篩選

樹脂型號的選型非常重要。按照大孔吸附樹脂分離原理，極性樹脂吸附強極性物質，非極性樹脂吸附弱極性物質，實驗擬選擇H103，D3520，D4020，D4006，AB-8，HZ806，NKA-2，NKA-9等8種大孔樹脂作為備用樹脂。

分別稱取經預處理好的各型號樹脂20 g裝柱，加入發酵液100 mL，收集流出液。吸附完水洗至中性，用75%乙醇解吸附，解吸附液減壓濃縮，72℃水浴鍋蒸干。用無菌水配置相同濃度的樣品(流出液、解吸附液、發酵液)，同時進行活性評價，通過抑菌圈直徑大小確定最佳樹脂(1 mL發酵液經干燥處理得干燥品2 mg，以此為鑒，后面抑菌活性都是2 mg/mL)。

1.2.3 提取參數的優化

準確稱取經預處理好的樹脂裝柱，針對吸附流速、上樣量、解吸附溶劑、解吸附體積、解吸附流速等因素分別對大孔樹脂進行考察，從而確定大孔樹脂的最佳提取條件。采用瓊脂擴散法測定活性，以抑菌圈直徑大小作為評價樹脂分離活性物質的指標。

2 結果與分析

2.1 樹脂型號篩選

對8種不同的樹脂進行吸附與解吸附實驗，實驗結果見圖1。

圖1 不同樹脂抑菌結果比較

由圖1可知:樹脂NKA-2對活性成分吸附較完全，流出液不具有抑菌活性;樹脂HZ806對活性成分完全不吸附，解吸附液不具活性;其余6種樹脂對活性成分具有不同程度的吸附作用，但都不完全，且流出液均具抑菌活性。由此可見，NKA-2為最理想的樹脂型號，因此實驗采用NKA-2作為后續動態吸附研究的樹脂類型。

2.2 提取參數的優化

發酵液經大孔樹脂NKA-2吸附后，必須根據其性質選擇合適的洗脫液。通常先用水將溶于水的一些雜質和未吸附到樹脂上的殘留在樹脂中的發酵上清液洗去，然后用不同比例或同一比例的乙醇進行梯度洗脫或直接洗脫。選用的溶劑應能使大孔網狀結構的吸附劑溶脹，這樣才可以減弱溶質與吸附劑之間的吸附力，并且所選用的溶劑要易溶解吸附物。

2.2.1 吸附流速影響

分別考察不同吸附流速對大孔樹脂吸附發酵液中活性成分的影響，實驗結果見圖2。

圖2 上樣流速對吸附的影響

注:泄漏點［4］用抑菌圈的大小來表示，即:如果開始泄漏，流出液就應該有活性;反之，流出液沒有活性。

在大孔樹脂動態吸附活性成分實驗中，流速是影響泄漏點的一個重要的因素。從圖2可以看出:當吸附流速為5 BV/h時，流出液活性最強，即泄漏點出現得最早。上樣量不足60 mL(1個BV)時已經開始泄漏，隨著流速的降低，泄漏點的出現也相應推遲。這是因為當流速過大時，發酵液與樹脂接觸的時間相對來說比較短，發酵液尚未充分地與樹脂的內表面相接觸就已經流出吸附柱，使其吸附的效率大為降低;而當流速較慢時，發酵液充分地與樹脂相接觸，有利于樹脂吸附。

從圖2可以看出:當流速為0.5 BV/h時，樹脂吸附效果最佳;但是與流速為2 BV/h的吸附效果相比，0.5 BV/h的優勢并不顯著，且更加費時、費力。綜合考慮，后續的實驗中選擇吸附流速為2 BV/h。

2.2.2 上樣量影響

大孔吸附樹脂的吸附作用主要是通過表面吸附、氫鍵等，其吸附力因而有一定的上限。當吸附達到飽和時，其對化學物質吸附作用減弱甚至消失，因此應選擇合適的上樣量進行上樣吸附。由于大孔樹脂NKA-2能吸附發酵液中的活性成分，因此，通過測定流出液是否有活性來初步判斷吸附飽和的終點，實驗結果見圖3。

圖3 上樣量對吸附的影響

在上樣量為1 000 mL的發酵液作用于20 g NKA-2樹脂的過程中，追蹤檢測流出液的抑菌活性，以此來計算達到泄漏點時的洗脫體積，從而得到該樹脂對該發酵液的最大吸附量。兩次實驗結果表明:當上樣量為400 mL時基本無泄漏，但多于400 mL時便出現較明顯的泄漏。此處柱高為30 cm，樹脂重量約為20 g，樹脂柱床體積約為60 mL。因此，該大孔樹脂對發酵液的最大吸附飽和度達到5%(即5 g樹脂能吸附100 mL發酵液)。

2.2.3 解吸附劑濃度影響

選用體積分數分別為15%，30%，45%，60%，75%，90%的乙醇對已經吸附飽和的NKA-2樹脂進行梯度洗脫。收集各梯度濃度的解吸附液配成2 mg/mL的濃度進行活性實驗，結果如圖4所示。

圖4 不同體積分數的乙醇對樹脂的解析附的影響

由圖4可知:活性物質主要集中于15%的乙醇解吸附液中，隨著乙醇濃度的增加，活性逐漸降低，到90%乙醇濃度時幾乎達到發酵液的抑菌水平。從實驗結果可知:濃度越大，解吸附液顏色越深，洗脫的雜質越多，因而配制同濃度的樣品活性逐漸降低;而15%乙醇解吸附液洗脫下的物質顏色較淺，活性最強，表明活性成分主要在15%乙醇中洗脫，因而選擇15%乙醇濃度作為最佳解吸附濃度。

2.2.4 解吸附流速影響

用15%的乙醇溶液以不同的流速對已經吸附飽和的樹脂NKA-2進行解吸附，設置6個不同的流速。解吸附流速對發酵液解吸過程影響見圖5。

圖5 不同流速對樹脂解吸附的影響

實驗結果表明:流速為0.5 mL/min和1.0 mL/min時，二者解吸附率接近;當解吸流速大于1.0 mL/min時解吸附率逐漸降低。綜合考慮解吸附率及時間效率問題，確定1.0 BV/h的流速為最佳解吸流速。

2.2.5 解吸附劑用量影響

采用不同量的15%乙醇對已經吸附同等量的飽和樹脂進行解吸附，設置6個不同柱體積考察對解吸附率的影響，實驗結果如圖6所示。

圖6 洗脫液體積對樹脂解析附的影響

從實驗結果可以看出:在一定范圍內，隨著解吸附溶劑量的增大，洗脫液對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的拮抗活性也隨之增加;當溶劑用量超過7 BV后，解吸附率不再增加，與溶劑用量為6 BV時比較接近;而當溶劑用量低于6 BV時，解吸附率明顯降低。綜合考慮解吸附溶劑成本及時間成本，確定以6 BV為最佳解吸附溶劑用量。

2.3 工藝驗證

從以上篩選結果可知最佳NKA-2提取活性物質參數為:吸附量5%，洗脫溶劑及濃度為15%乙醇溶液，洗脫體積6 BV，吸附流速2 mL/min，解吸附流速1 mL/min。本工藝經3批中試放大，進行了提取活性物質與萬古霉素在相同濃度下(提取活性物質經干燥后，稱取與萬古霉素相同質量，經水溶解)的活性比較實驗，實驗結果見圖7。由圖7可看出:萬古霉素產生的抑菌圈大小為30 mm，而我們的提取物抑菌圈大小為35 mm。若將其進行進一步精制，其抑菌效果必定更強，故具有較大的研究價值。

圖7 解吸附液的抗MRSA活性比較

3 結論與討論

文獻報道芽孢類桿菌代謝產生的生物活性成分種類繁多，分離純化方法也各不相同，常見的方法有硫酸銨沉淀法、酸沉淀法、溶劑萃取法等。本課題曾將這幾種方法進行了比較，發現由于活性物質含量較低，用這些方法提取的雜質較多，選擇性不好，后續處理麻煩，經多步處理后收率極低，不利于后期的分離純化。

經反復比較提取方法，最終確定采用大孔吸附樹脂提取。根據極性相似的原則，并結合實驗室現有條件，比較了8種不同型號樹脂對菌株產活性物質的吸附情況。NKA-2型吸附樹脂由于選擇性好，吸附量大，因此確定為一理想的吸附樹脂。通過對大孔吸附樹脂提取參數，包括上樣流速、上樣量、解吸附液濃度、解吸附液體積等進行考察，最終確定了大孔吸附樹脂提取參數。經該工藝處理后，活性物質得到極大富集，大量雜質被去除，為后續分離純化提供了方便，可作為工業化生產的工藝路線。

本文在課題組已有的研究基礎上，對篩選菌株產活性物質進行提取工藝研究。對菌株種的鑒定已另文發表，詳見文獻［5］。接下來會進一步對提取物進行分離純化，進行物質基礎研究，期許能發現一種全新結構的抗MARA先導化合物，并為基于此的藥物開發提供實驗依據。

［1］Enright M C，Robinson D A，Randle G，et al.The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococci aureus(MRSA)［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2002，99 (11):7687-7692.

［2］羅春陽，陳孝治.MRSA治療藥物概述［J］.中華臨床醫藥，2002，3(3):57-60.

［3］王健，林毅，王海燕，等.大孔吸附樹脂提取分離去甲基萬古霉素的工藝研究［J］.化學與生物工程，2010，27(5):76-79.

［4］張東方，信穎.中藥現代分離技術［M］.沈陽:遼寧大學出版社，2006.

［5］江娟，鄒遠軍，張云玲，等.抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株的篩選與鑒定［J］.現代食品科技，2013，29 (4):788-791.

(責任編輯 何杰玲)

Extraction Process of Anti-MRSA Activity Substance
by Macroporous Resin

LIU Hong，JIANG Juan，ZHANG Xin-rui，CHEN Hai-qin，XU Xiu-ying

(School of Pharmacy and Bioengineering，
Chongqing University of Technology，Chongqing 400054，China)

To optimize the macroporous resin extraction process of active substance which has the activity of anti-MRSA from microbial fermentation broth，the most effective resin and the operation conditions were selected by single factor experiment.The optimal adsorption resin for extracted active substance is NKA-2.The main technical parameters are as follows:adsorption volume is 5%，the 15%ethanol as eluent solvent，washing volume is 6 BV，adsorption velocity is 2 mL/min，desorption velocity is 1 mL/min.The method has the characteristics of environmental protection，energy saving，and easy operation which can be used for industrial production.

macroporous resin;Staphylococcus aureus;extraction;process

Q93-33

A

1674-8425(2014)06-0074-04

10.3969/j.issn.1674-8425(z).2014.06.014

2013-01-09

科技部重大新藥創制專項(2010ZX09401-306-2-23);重慶市科委項目(2009JGF10023);重慶理工大學研究生創新基金資助項目(YCX2012322)

劉紅(1987—)，女，碩士，主要從事微生物藥物研究;通訊作者胥秀英(1965—)，女，副教授，主要從事新藥及藥物分析研究。

劉紅，江娟，張心蕊，等.大孔樹脂法提取抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性物質的工藝研究［J］.重慶理工大學學報:自然科學版，2014(6):74-77.

format:LIU Hong，JIANG Juan，ZHANG Xin-rui，et al.Extraction Process of Anti-MRSA Activity Substance by Macroporous Resin［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014(6):74-77.