大豆異黃酮對成骨細胞增殖活性的測定和BGP mRNA的表達

宋 梅 王淑芳 黃永凱 王紅梅

（武警內蒙古總隊醫院腎內科，內蒙古 呼和浩特 010010）

大豆異黃酮對成骨細胞增殖活性的測定和BGP mRNA的表達

宋 梅 王淑芳 黃永凱 王紅梅

（武警內蒙古總隊醫院腎內科，內蒙古 呼和浩特 010010）

目的研究不同濃度的大豆異黃酮對體外培養大鼠成骨細胞增殖活性和骨鈣素（BGP）基因表達的影響。方法采用新生大鼠顱骨分離培養成骨細胞，加入不同濃度的大豆異黃酮（20、40、60、80 μg/μL），另設空白對照組。MTT法測成骨細胞增殖活性。提取細胞總RNA，RT-PCR半定量分析細胞BGP mRNA表達。結果MTT結果顯示，60和80 μg/μL組成骨細胞增殖活性與對照組相比顯示增高，有統計學意義（P＜0.05）。RT-PCR結果顯示：60和80 μg/μL組BGP mRNA表達增強，有統計學意義（P＜0.01）。結論大豆異黃酮可以促進成骨細胞的增殖活性和BGP基因上調，并呈明顯的劑量依賴關系。

大豆異黃酮；成骨細胞；骨鈣素

隨著老齡化時代的到來，絕經后骨質疏松癥患病率逐年增高。雌激素治療雖能減少絕經后婦女的骨丟失及骨折發生率[1]，但同時也增加了患乳腺癌和子宮內膜癌的風險[2，3]。近年來，植物雌激素以其在女性健康中的潛在作用而成為研究的熱點，為防治絕經后骨質疏松提供了一條新思路。

大豆異黃酮類（isoflavones）主要是糖苷結合形式的染料木苷和黃豆苷，在體內細菌作用下，釋放出具有生物活性的物質被吸收。近年研究表明，大豆異黃酮在動物試驗和人群調查中對骨骼代謝、預防骨質疏松有重要作用，但在細胞水平，一直尚少有報道。本實驗結合血清藥理學方法采用體外細胞培養，目的在于從胞內信號轉導水平探索成骨細胞骨鈣素（BGP）的基因表達變化，研究大豆異黃酮防治骨質疏松癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

低糖DMEM培養液、HEPES、胎牛血清（聯星生物有限公司）、MTT（南京建成生物有限公司）。RNA試劑盒（美國GIBCO），逆轉錄酶為Roche公司。大豆異黃酮購自天津市康寧生物化學工程有限公司，總含量為50.27%。

1.2 原代成骨細胞的培養

將新生SD大鼠（中國醫科大學實驗動物中心）放入75%酒精中浸泡消毒15 min，無菌操作下取出顱蓋骨。除去附著的血管及結締組織，用PBS溶液清洗3次。剪成l mm×l mm大小的碎塊。加入0.25%胰蛋白酶，于37 ℃消化30 min，棄去消化液，PBS溶液清洗干凈后，加入0.02%Ⅱ型膠原酶，于37 ℃消化5次，每次20 min，棄除前兩次消化液，取最后3次消化液，1000 r，離心10 min。棄上清液，所得白色沉淀物即為制得的成骨細胞樣細胞團。用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養液重懸細胞至2×104/mL的細胞懸液，吹打均勻后。接種到100 mL培養瓶。置入37 ℃，含5% CO2飽和濕度的培養箱內進行培養，24 h換液。棄去懸浮細胞.每隔2 d換液1次。

1.3 細胞增殖MTT測定方法

取培養至第3代的成骨細胞以1×105個/mL密度接種于96孔培養板，每孔300 μL，24 h細胞貼壁后，棄培養液，分別加入含有大豆異黃酮（20、40、60、80 μg/μL）濃度培養液，另設加DMEM培養液作為陰性對照，每組8孔。繼續培養48 h后，每組分別收集50 μL上清液。每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，終止培養，小心吸棄上清；每孔加入DMSO溶液150 μL，振蕩10 min，立即測定吸光度值（波長490 nm）。比較各組OD值的大小。

圖1 大豆異黃酮對成骨細胞增殖活性測定

1.4 大豆異黃酮對成骨細胞BGP基因表達的影響

1.4.1 細胞總RNA提取

培養細胞經消化后，棄消化液，PBS洗滌2次；加入TRIZOL細胞裂解液。刮下細胞，連同裂解液一起轉移至新的1.5 mL，Ep管中，室溫放置5 min。加氯仿0.2 mL，劇烈震蕩振蕩15 s，室溫靜置3 min，4 ℃離心，12000 r，15 min，小心吸取上層水相，移至另一1.5 mL Ep管中。加等體積異丙醇，室溫放置10 min，4 ℃離心，12000 r，10 min。棄上清，加預冷75%乙醇1 mL，旋渦振蕩充分洗滌總RNA沉淀，4 ℃離心，12000 r，5 min。棄上清，快速離心5 s，將管底殘余乙醇用移液器小心吸去，室溫下晾干沉淀20 min。加20 μL無RNA酶水，溶解總RNA沉淀，用分光光度計測定其在260、280 nm處OD值，以確定核酸的純度及濃度，并按照公式[mRNA]（μg/μL）=OD260×40×稀釋倍數/1000。

1.4.2 RT-PCR

取3μg總RNA用TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver試劑盒逆轉錄合成cDNA。再用9700型PCR擴增儀（PE公司）進行PCR。BGP引物利用primer3軟件設計，BGP上游：5'-GCA GGA GGG CAA TAA GGT-3'；BGP下游：5'-CGT AGA TGC GTT TGT AGGC-3'。用于擴增BGP基因cDNA，片段大小為164 bp。擴增條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 20 s，共30個循環。β-actin引物序列，上游：5'-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3'；下游：5'-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AACA-3'，擴增片段：300 bp。擴增條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，55 ℃30 s，68 ℃ 20 s，共30個循環。

1.4.3 PCR產物半定量分析

取5 μLPCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL EB），120 V恒壓，40 min，紫外透射儀上觀察結果，凝膠分析軟件對電泳譜帶進行半定量分析，用任意單位（AU）表示凝膠譜帶的面積×熒光強度值，BGP與β-actin的AU比值代表各自的mRNA相對表達水平。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 不同濃度的大豆異黃酮對成骨細胞增殖活性MTT結果顯示：隨大豆異黃酮濃度的上升，成骨細胞增殖活性呈上升趨勢。其中，60、80 μg/μL與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 大豆異黃酮對成骨細胞增殖活性測定

2.2 RT-PCR半定量結果顯示

與對照組（0.5386±0.028）相比，20 μg/μL（0.5620±0.020）和40 μg/μL（0.6228±0.012）組BGP mRNA表達沒有統計學意義（P＞ 0.05）；60 μg/μL（0.7813±0.010）和80 μg/μL（0.8121±0.013）組BGP mRNA表達增強，有統計學意義（P＜0.01）（圖1，圖2）。

圖2 大豆異黃酮對成骨細胞BGP mRNA表達

3 討 論

骨組織中存在的細胞主要有3種：骨細胞、成骨細胞、破骨細胞。其中成骨細胞是骨組織中最活躍的細胞。成骨細胞存在于骨的表面以及骨間隙的孔隙內。其主要功能是合成、分泌骨基質并促進基質礦化形成骨組織[4-6]。骨鈣素是成骨細胞合成分泌的一種非膠原蛋白，是反映成骨細胞分化成熟的指標，能準確表示成骨細胞的活性。當骨形成和骨吸收耦聯時，骨鈣素的主要生理作用是反映骨轉換的指標；當骨形成和骨吸收解耦聯時，骨鈣素是反映骨形成的特異指標；它能準確反映成骨細胞的成骨功能[7，8]。

大豆異黃酮是植物雌激素的一種，主要包括大豆苷原、染料木黃酮和黃豆黃素，它們的結構與雌激素相似。本實驗通過不同濃度的大豆異黃酮對體外培養的成骨細胞的增殖活性和BGP基因表達影響，結果表明，大豆異黃酮可以增加細胞水平的成骨細胞的增殖活性，并隨濃度的增大呈上升趨勢。在基因水平上，大豆異黃酮可促進大鼠成骨細胞BGP基因的表達，亦表現出明顯的劑量依賴關系。由此可以推測，大豆異黃酮對骨骼代謝、預防骨質疏松的作用，可能是促進成骨細胞的增殖活性和增加細胞中BGP基因表達而介導，并表現出明顯的劑量依賴關系。細胞培養研究表明，大豆異黃酮對成骨細胞增殖、大鼠骨代謝有促進作用，但其機制仍需進一步研究。成骨細胞增殖、分化的過程是一個受多種因素調節的復雜過程，其可能受到多種因素的影響。

[1] ConnellD,RobertsonJ,HenryD,et al.A systemic review of the sekeletal effects of estrogen therapy in postmenopausal women.ⅡAn assessment of treatment effects[J].Climacteric,1998,1(2):112-123.

[2] Writing Group for the Womens Health Initiative Investigations.Risk and Benefits of estrogens plus progestin in healthy postmenopausal women:principal results from the Womens Health Initiativ controlled trial[J].JAMA,2002,288(3):321-333.

[3] Lacey JV Jr,Mink P J,Lubin JH,et al.Menopausal hormon replacement therapy and the risk of ovarian cancer[J].JAMA,2002, 288(3):334-341.

[4] Bielby R C,Boccaccini A R,Polak JM,et al.In vitro differentiation and in vivo mineralization of osteogenic cells derived from human embryonic stem cells[J].Tissue Eng,2004,10(9/10):1518-1525.

[5] 胡立桉,陳衛民,毛靖.持續壓力對大鼠成骨細胞堿性磷酸酶分泌活性的影響[J].臨床口腔醫學雜志,2003,2(19):79-81.

[6] 李月白,胡新永,王義生.辛伐他汀與地塞米松對成骨細胞內皮細胞型一氧化氮合酶基因表達及增殖的影響[J].中華骨科雜志, 2006,26(9):614-617.

[7] Dost P,Ten Cate WJ,Wiemann M.Osteoblast like cell cultures from human stapes[J].Acta Otolaryngol,2002,122(8):836-840.

[8] 揚林,陶天遵,劉楓晨,等.地塞米松對成人成骨細胞增殖和分化影響的實驗研究[J].中華骨科雜志,2001,21(8):493-497.

Effect of Isoflavones on Cell Proliferation Activity and Gene Expression of BGP mRNA in Cultured Rat Osteoblasts

SONG Mei, WANG Shu-fang, HUANG Yong-kai, WANG Hong-mei
(Department of Nephrology, Inner Mongolia Armed Police Hospital, Hohhot 010010, China)

ObjectiveTo study the effect of different concentrations of isoflavones on gene expression of BGP mRNA and cell proliferation activity in cultured rat osteoblasts.MethodsNewborn rat calvarid osteoblastic cell were isolated and cultured. They were cultured in medium with various concentration isoflavones(20, 40, 60, 80 μg/μL), compared to control group. The proliferation activity by MTT method. The total RNA was extracted by TRIZOL and analyaed with semi-quantitative RT-PCR.ResultsCompared to control group, the cell proliferation activity of 60 and 80 μg/μLgroup was significantly promoted(P＜0.05), the cell BGP mRNA expression of 60 and 80 μg/μL group was significantly upregulated(P＜0.01).ConclusionThe isoflavones could increase cell proliferation activity and expression of BGP mRNA. The effect was similar to estrogen.

Isoflavones; Osteoblast; Bone morphogenetic protein

R318

B

1671-8194（2014）27-0071-02