真性紅細胞增多癥基因組學與疾病進展的關系*

趙迎旭 白 潔 張 磊 盛夢瑤 石 慧 邢 文 楊逢春 艾麗梅 周 圓

真性紅細胞增多癥基因組學與疾病進展的關系*

趙迎旭1,2白 潔2張 磊2盛夢瑤2石 慧2邢 文2楊逢春2艾麗梅1△周 圓2

目的 研究135例真性紅細胞增多癥(PV)患者ASXL1、TET2、IDH1、IDH2、SETBP1、MPL515、JAK2V617F及JAK2 exon12基因突變情況，綜合評判PV后骨髓纖維化（PPMF）疾病進展與基因組學特征。方法用Sanger方法對ASXL1、TET2、IDH1、IDH2、SETBP1、MPL515和JAK2 exon12基因進行測序；用巢式等位基因特異性PCR方法檢測JAK2V617F突變，對突變患者用Taqman-MGB探針檢測突變負荷。分析基因突變與PPMF疾病進展的關系。應用Logistic多因素分析分析PV后繼發PPMF的危險因素。結果PV患者ASXL1、TET2、IDH1、IDH2的突變率分別為7.69%（8/104）、5.26%(1/19)、0.08%(1/120)、和0.08%(1/121)。未發現SETBP1、MPL515突變者。PV患者JAK2總突變率為82.22%（111/135）。其中JAK2 exon12突變率為2.96%(4/135)。PPMF患者中，ASXL1突變率高達31.82%（7/22）。ASXL1與JAK2V617F負荷(V617F%)呈正相關（rs=0.298，P=0.002），ASXL1突變組的血紅蛋白低于未突變組，白細胞、V617F%≥50%比例、血栓栓塞比例及繼發PPMF比例高于未突變組（P＜0.05）；ASXL1突變、V617F%≥50%和脾大是PPMF的危險因素。結論ASXL1突變可能通過某種機制促進V617F%增高，參與PPMF的發生和發展。

真性紅細胞增多癥；基因組學；ASXL1；TET2；IDH1；IDH2；SETBP1；MPL515；JAK2V617F;JAK2 exon12

真性紅細胞增多癥(PV)是骨髓增殖性腫瘤（MPN）的典型代表，PV后繼發骨髓纖維化（PPMF）和急性白血病（AML）轉化是PV疾病進展的主要表現。研究表明超過90%的PV患者存在非受體型酪氨酸激酶JAK2V617F突變[1-2]。近年來，包括表觀遺傳學和剪切子相關的基因組學異常在MPN發生和疾病進展中的作用得到了學者的重視[3]。本研究通過檢測并分析135例PV患者的ASXL1（黑腹果蠅附加性梳樣結構-1，外顯子12）、TET2（10-11易位癌基因家族成員2，12個外顯子）、IDH1、IDH2（異檸檬酸脫氫酶1和2，外顯子4）、SETBP1（SET結合蛋白1）以及經典的JAK2V617F、JAK2外顯子12（JAK2 exon12）、MPL515（骨髓增殖性白血病病毒，外顯子10）等基因突變情況，并對有意義的基因突變與PPMF等疾病進展進行相關研究，以期探討表觀遺傳學相關基因異常在PV疾病進展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年11月—2013年6月中國醫學科學院血液病醫院收治的PV患者135例。診斷依據2008年WHO標準[4]。所有患者均簽署知情同意書，本研究獲得中國醫學科學院血液病醫院倫理委員會批準。

1.2 定義及分組 PV骨髓纖維化時間定義為PV疾病診斷至患者發生PPMF之間的時間。高白細胞（WBC）定義為WBC≥25×109/L；高血小板（Plt）為Plt≥600×109/L。

JAK2V617F按照 V617F%值分為 V617F%≥50%組和V617F%＜50%組。治療情況分無治療、放血治療或干擾素治療組（第1組）；羥基脲治療組（第2組）。

1.3 方法

1.3.1 Sanger測序 采集患者外周血，-80℃保存，應用血液基因組柱式小量提取試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）提取DNA。采用Sanger測序檢測ASXL1、TET2、IDH1、IDH2、SETBP1、MPL515以及JAK2 exon12編碼序列突變情況。PCR擴增體系為40 μL：含200 ng模板DNA、上下游引物各20 pmol，余體積用Platinum PCR Super Mix(Invitrogen)補足。PCR擴增條件：95℃5 min；95℃30 s，54℃25 s，72℃30 s，40個循環；72℃10 min。產物由北京天一輝遠公司進行純化測序，測序結果應用DNASIS MAX軟件進行分析，所有突變樣品用另外1個獨立PCR產物進行證實。所參考GenBank信息分別是 ASXL1：NM_015338.5；TET2：NT_ 016354.18；IDH1：NG_023319.2；IDH2：NG_023302；SETBP1：NG_027527；JAK2exon12：NG_009904.1；MPL515：NG_ 007525.1。

1.3.2 等位基因特異性PCR 應用巢式等位基因特異性PCR檢測JAK2V617F突變情況。引物如下：P25′-CCTCAGAACGTTGATGGCA-3′，P2r 5′-ATTGCTTTCCTTTTTCACAAGA-3′，Pnf 5′-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATG-3′，Pmr 5′-GTTTTACTTACTCTCGTCTCCACAAAA-3′。PCR條件同1.3.1。PCR產物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳后于紫外線下分析，產物為453 bp、279 bp和229 bp3種類型。279 bp為JAK2V617F突變型，229 bp為野生型。當DNA樣本含量較低時，先用引物P1 5′-GATCTCCATATTCCAGGCTTACACA-3′和P1r 5′-TATTGTTTGGGCATTGTAACCTTCT-3′預擴增，再取1 μL預擴增產物用上述巢式PCR進行二次擴增。

1.3.3 Taqman-MGB探針實時定量PCR 將上述方法測定的JAK2V617F陽性標本應用StepOne實時定量PCR儀進行檢測。引物為：上游5′-AAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTT-3′，下游5′-AGAAAGGCATTAGAAAGCCTGTAGTT-3′；JAK2野生型Taqman探針VIC-5′-TCTCCACAGACACATAC-3′；JAK2突變型Taqman探針FAM-5′-TCCACAGAAACATAC-3′。PCR條件同1.3.1。應用JAK2V617F突變純合子與表達野生型JAK2的PV標本以不同比例混合后繪制標準曲線；突變負荷計算公式為：JAK2V617F/（JAK2V617F+JAK2WT）；檢測敏感度為1%。

1.4 統計學方法 應用SPSS 21.0軟件進行分析，定性資料比較用χ2檢驗；連續變量比較用獨立樣本t檢驗。變量的相關性分析用Spearman相關。采用Logistic回歸分析影響PPMF發生的危險因素；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PV患者的臨床特征及基因突變情況 135例PV患者中男75例，女60例；年齡23～82歲，平均59歲；其中脾大64例(47.4%)，白細胞(4.12～39.92)×109/L；血小板351(107～1 107)×109/L；23例合并PPMF，占17.04%。ASXL1、TET2、IDH1、IDH2、JAK2、JAK2V617F、JAK2exon12突變情況見表1。未發現SETBP1、MPL515突變。

Table 1 Genetic mutations in PV patients表1 PV患者基因組學特征 例（%）

2.2 ASXL1突變和PV患者臨床特征、疾病進展的關系 ASXL1突變組的血紅蛋白低于未突變組，白細胞、V617F%水平、V617F%≥50%比例、有血栓栓塞比例及合并PPMF比例高于未突變組（P＜0.05），見表2。ASXL1與V617F%呈正相關（rs=0.298，P= 0.002）。

在可檢測的22例PPMF患者中（1例未做檢測），ASXL1突變7例（31.82%）。但是無PPMF的PV患者中僅1例ASXL1突變（1/112，0.89%）。將ASXL1突變PV患者的其他基因情況做組合分析，結果顯示所有ASXL1突變患者均為JAK2V617F突變，且V617F%較高。未發現其與TET2/IDH1/IDH2突變同時發生，見表3。

Table 2 Correlation of ASXL1 mutation with clinical features表2 ASXL1突變與臨床特征的關系

Table 3 Abnormal genetic characteristic in 11 PV patients表3 11例PV患者基因組學異常情況

2.3 JAK2V617F突變負荷與PV患者臨床特征的關系 V617F%≥50%組的女性比例、高血小板比例、高白細胞比例、血栓栓塞比例和合并PPMF比例高于V617F%＜50%組（P＜0.05），見表4。

Table 4 The correlation of JAK2V617Fmutation load with clinical features表4 JAK2V617F突變與臨床特征的關系 例（%）

2.4 PPMF危險因素的Logistic分析 以是否合并PPMF為應變量（是=1，否=0），以性別(女=0，男=1)、治療分組（第1組=0，第2組=1）、脾大(是=1，否=0)、白細胞數、血小板數、ASXL1突變(是=1，否=0)和V617F%（≥50%=1，＜50%=0）為自變量，進行Logistic多因素回歸分析，結果顯示ASXL1突變、V617F%≥50%和脾大是PPMF的危險因素，見表5。

Table 5 Logistic regression analysis for post-PV myelofibrosis risk factors表5 PPMF危險因素的Logistic分析結果

3 討論

ASXL1通過與梳樣結構抑制物復合體2（PRC2）發生反應，影響組蛋白的翻譯、修飾，起到抑制癌癥的作用[5]。文獻報道ASXL1在特發性骨髓纖維化(PMF)中的發生率為13%～36%[6]，而關于ASXL1在PPMF中突變情況的報道較少見。僅Abdel-Wahab等[7]提出ASXL1在原發性血小板增多癥（ET）/PV后MF中的突變率為23%，且其沒有對EPMF和PPMF進一步精確分析。本研究發現ASXL1在PPMF患者中有更高的突變率（31.82%），而在無PPMF的PV患者中發生比較低，僅為0.89%。且本組患者中ASXL1突變患者具有較高的V617F%。這可能由于ASXL1突變后對于BAP1等的募集減少，影響到JAK2基因的表達及造血微環境的變化，利于PPMF的發生[5]。本研究還發現ASXL1突變患者的血栓栓塞發生率高，可能是由于ASXL1突變后，其抑癌基因的作用消失，白細胞增多更為明顯所致[8]。本研究結果表明ASXL1突變組血紅蛋白水平相對較低，可能與ASXL1突變PV患者的高骨髓纖維化傾向有關。和Brecqueville等[9]的研究結果不同，本研究沒有發現ASXL1突變與高年齡及性別有關。但發現患者年齡＜65歲、女性發生ASXL1突變比率偏高。TET2、IDH1/IDH2突變均可通過DNA高甲基化，引起髓系細胞功能改變，參與MDS/MPN和AML的發生發展[9]。文獻報道TET2、IDH1/IDN2突變在MPN的發生率分別為16%～26%和2%～4%[10-13]。本研究中TET2、IDH1、IDH2突變各1例，比例較低，且此3例均為高齡患者，V617F%較高。

SETBP1是多功能SET蛋白的結合伴侶[14]，參與細胞的凋亡、轉錄和核小體組裝。MPL515是血小板生成素受體基因，參與巨核細胞增殖[15]。文獻報道SETBP1發生在2.5%PMF和4.5%的慢性粒單核細胞白血病（CMML）患者[16-17]，MPL515突變發生3%ET、10%PMF和5%MPN轉化為AML的患者[15,18]。本研究未發現SETBP1和MPL515突變存在于PV和PPMF患者。

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（2014-02-14收稿 2014-04-20修回）

（本文編輯 閆娟，陳麗潔）

讀者·作者·編者

《天津醫藥》第七屆編輯委員會委員名單

Correlation of Genomic Characteristic with Disease Progression in Polycythemia Vera

ZHAO Yingxu1,2，BAI Jie2，ZHANG Lei2，SHENG Mengyao2，SHI Hui2，XING Wen2，YANG Fengchun2，AI Limei1，ZHOU Yuan2
1 Department of Hematology,The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Jinzhou 121001,China；2 State Key Laboratory of Experimental Hematology,Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

ObjectiveTo screen mutations in genes including ASXL1,TET2,IDH1,IDH2,SETBP1,MPL515, JAK2 exon 12 and JAK2V617in 135 polycythemia vera(PV)patients.To assess progreasson and genomics characteristics post polycythemic myelofibrosis.MethodsDNA sequencing of ASXL1(Exon12)，TET2(Exons 3-11)，IDH1(Exon4)，IDH2(Exon4)，SEPBP1(Exon4)，JAK2 exon 12 and MPL515(Exon 10)genes were carried out using Sanger method.JAK2V617mutation was detected by allele-specific PCR in patients with PV.In the mean time,the mutation load of JAK2V617Fallele (V617F%)was evaluated by real-time PCR using Tagman MGB probe.Then,the significant of gene mutations and clinical outcomes of post-PV Myelofibrosis（PPMF）was analyzed.To study risk factors of PPMF,logistic regression were employed.ResultsASXL1,TET2,IDH1,IDH2 were mutated in 7.69%（8/104）,5.26%(1/19),0.08%(1/120)and 0.08%(1/121)of all PV patient respectively.JAK2 was mutated in 82.22%(111/135)of PV patients with mutation rate of exon12 of 2.96%(4/ 135)and there were no mutation of MPL515 and SETBP1 in PV patients.ASXL1 mutation was found in 31.82%（7/22）PPMF patients.Spearman analysis showed that ASXL1 is correlated with JAK2V617F(V617F%)(rs=0.298，P=0.002).The hemoglobin was lower in patients with ASXL1 mutation than patient without mutation(wild type).Leukocyte count,V617F%＞50% rate,thrombosis and PPMF were higher in patients with ASXL1 mutation than that of ASXL1 wild type（P＜0.05）.ASXL1 mutation,V617F%＞50%rate and splenomegaly were all risk factors of PPMF.ConclusionASXL1 mutation is the risk-factor of PPMF and may promote V617F%by some mechanism.

polycythemia vera;genomics;ASXL1；TET2；IDH1；IDH2；SETBP1；MPL515；JAK2V617F；JAK2 exon12

R555.1

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.002

*國家高技術研究發展計劃(863計劃，項目編號：2012AA02A211)；國家自然科學基金面上項目（項目編號：81370610）；天津市自然科學基金基礎重點項目（項目編號：13JCZDJC31200）；遼寧省科技廳項目（項目編號：2011225015）

1遼寧醫學院附屬一院血液科（郵編121001）；2中國醫學科學院北京協和醫學院血液病醫院（血液學研究所）實驗血液學國家重點實驗室

△通訊作者 E-mail:janebai86@126.com