GDNF、GFRα1和RET在先天性直腸肛門畸形中的表達及意義*

張 輝 詹江華

GDNF、GFRα1和RET在先天性直腸肛門畸形中的表達及意義*

張 輝1詹江華2△

目的 探討神經膠質細胞源性的神經營養因子（GDNF）、其受體GFRα1和原癌基因RET在先天性直腸肛門畸形腸壁組織中的表達及意義。方法收集經手術治療的直腸肛門畸形患者12例，男8例，女4例，年齡3 d～2歲，高位無肛2例，中位無肛4例，低位無肛6例。采用免疫組織化學和逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）分別檢測12例患兒腸壁盲端組織和距離盲端3 cm處的組織標本中RET、GDNF和GFRα1的表達。結果高、中、低位無肛患兒盲端標本中均缺乏神經節細胞，且RET、GDNF和GFRα1在盲端中均未見表達；距離盲端3 cm處，高、中、低位無肛組織中有神經節細胞，存在RET、GDNF和GFRα1的表達，中、低位無肛組織中呈棕褐色為強陽性，而高位無肛呈淡黃色和棕黃色為弱陽性或者陽性；術后功能隨訪，高位無肛中1例出現污糞，1例出現稀便不能控制，無肛門失禁情況。中、低位無肛中有1例出現直腸黏膜脫出，經坐浴肛門護理好轉，1例出現排氣時偶有污便，其余8例術后排便功能未見異常。結論先天性直腸肛門畸形患兒的直腸末端中神經營養因子GDNF、GFRα1和RET的低表達可能與直腸肛門畸形術后排便功能不良關系密切。

肛門閉鎖；膠質細胞源性神經營養因子類；膠質細胞源性神經營養因子受體；原癌基因蛋白質cret；免疫組織化學；逆轉錄聚合酶鏈反應

先天性直腸肛門畸形術后常出現便秘和失禁，是困惑小兒外科醫生的問題之一。醫生時常通過改變手術方式試圖達到家長滿意的療效，但往往事與愿違，手術方式改變了，但是便秘和功能不良的情況依然存在。初步研究證實，直腸肛門畸形患兒常伴隨肛門周圍肌肉發育異常、神經節和神經叢的減少或缺失，最終影響腸道排便功能，導致術后肛門功能不良，這些改變通常與神經營養因子關系密切[1]。目前研究較多的神經營養因子包括特異性烯醇化酶（NSE）、S-100、Cajal及神經細胞黏附因子（NCAM）等[2]。但還有一些與神經節細胞功能表達密切相關的因子，包括神經膠質細胞源性的神經營養因子（GDNF）、其受體GFRα1及原癌基因RET在直腸肛門畸形中表達的研究較少[3]。本研究通過觀察直腸肛門畸形患兒直腸盲端的神經營養因子的表達，以期了解直腸盲端神經節細胞分布，以及此類神經營養因子與新肛門功能之間的關系。

1 資料與方法

1.1 病例來源 選擇2009年1月—2012年12月在我院外科手術治療的直腸肛門畸形患者12例，其中男8例，女4例，手術時年齡3 d～2歲。12例中高位2例，中位4例，低位6例。手術方式分別采用腹腔鏡輔助肛門成形術，中低位無肛采用倒“Y”肛門成形術。圍手術期恢復順利，無相關合并癥發生，隨訪結果滿意。

1.2 手術標本處理 所有患者在進行肛門成形手術時，分別在直腸盲端和距離閉鎖盲端3 cm處留取標本，其中新鮮標本提取RNA逆轉錄后行PCR檢測相應神經營養因子表達；另外石蠟包埋組織切片分別檢測神經節細胞分布情況，免疫組化檢測各類神經營養因子在腸壁內的表達情況。

1.3 免疫組化方法 標本經中性福爾馬林液固定，常規石蠟包埋，連續切片。免疫組化采用SP法，用已知陽性片做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照。所用RET、GDNF和GFRα1抗體為美國Zymed公司產品，工作濃度1∶50。過氧化物酶SP試劑盒及EDTA修復液購自北京中山生物技術公司。結果判定：以細胞質出現棕黃色顆粒為陽性表達。高倍鏡下隨機讀取每5個視野單位面積內黏膜下神經叢及肌間神經叢數目，計數神經叢內陽性細胞數目。

1.4 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR） 分別選取直腸盲端和距離盲端3 cm處直腸組織，采用Trizol一步法提取試劑盒（Invitrogen,Paisley,UK）提取總RNA，經RNeasy Column（Qiagen,Hilden,Germany）去除小片段，逆轉錄后，進行PCR。引物序列見表1。引物由上海生工生物技術有限公司合成。PCR反應體系25 μL，反應條件：94℃，4 min，94℃，60 s，66℃，60 s，72℃，60 s；共30個循環，后延伸72℃，10 min。PCR產物使用2%添加EB的電泳膠進行電泳。

Table 1 Primer sequences of RET,GFRα1 and GAPDH表1RET、GNDF、GFRα1及GAPDH引物序列

2 結果

2.1 手術后肛門功能隨訪結果 本組患者均獲得隨訪，術后隨訪3個月～4年。2例高位無肛患者中1例出現污糞，1例出現稀便不能控制，無肛門失禁情況。中、低位無肛患者中1例出現直腸黏膜脫出，經坐浴肛門護理好轉，1例出現排氣時偶有糞便排出情況。其余8例術后排便功能未見異常。

2.2 GDNF、GFRα1和RET蛋白表達 HE染色顯示無論是高位、中位和低位無肛，直腸盲端均未見神經節細胞，而在距離直腸盲端3 cm處取材的組織中可見神經節細胞，只是細胞數量不同。低位和中位無肛距離直腸盲端3 cm處可以見到數量和形態均正常的神經節細胞，而高位無肛有神經節細胞，但是神經節細胞數量少、形態小。

免疫組化染色顯示患者直腸盲端組織中均未見3種蛋白表達；距離直腸盲端3 cm處組織中可見3種蛋白表達，中、低位無肛3種神經營養因子的表達呈棕褐色為強陽性（+++），而高位無肛呈淡黃色和棕黃色為弱陽性或者陽性（+～++），見圖1；與神經節細胞的分布情況相一致。

2.3 RT-PCR結果 低位、中位和高位腸壁組織中存在內參GAPDH的表達，GDNF、GFRα1、RET均是低位無肛表達最高，中位無肛表達次之，高位無肛表達最低，見圖2。

3 討論

目前先天性直腸肛門畸形是小兒外科比較常見的先天性發育畸形，文獻報道在新出生嬰兒中其發病率為1/1 500～1/5 000[4]。肛門直腸畸形的種類繁多，病理改變復雜，不僅肛門直腸本身發育缺陷，肛門周圍肌肉-恥骨直腸肌、肛門外括約肌和肛門內括約肌均有不同程度的改變，腸道神經系統改變也是重要病理改變。腸壁內神經節細胞的發育依賴其神經營養因子的支持和維護[5]。研究證實，在直腸肛門畸形腸壁組織中缺乏NSE、S-100和C-kit表達與肛門功能關系密切[2]。但是與神經節細胞發育、遷移、定植功能密切相關的GDNF、GFRα1、RET的功能表達尚少見報道。RET和GDNF是腸道神經節細胞發育最重要的營養和信號傳輸系統，其存在預示神經節細胞可能在胚胎期發育成熟。如表達缺失則可能伴有神經節細胞的發育過程受阻，引起其定植、遷移和成熟過程受阻。

Figure 2 PCR results of GDNF,GFRα1and RET transcription in tissue of congenital imperforate anus圖2 GDNF、GFRα1和RET在先天性直腸肛門畸形腸組織的PCR結果

GDNF及其家族是屬于糖蛋白，與RET結合緊密，本身具有獨特的信號傳輸途徑[6]。GDNF可抑制由RET基因引起的神經細胞凋亡，且這一抑制過程在RET基因的5種突變中均可見到。GDNF是神經營養因子，在體外研究中可見GDNF有促進神經節細胞存活的作用。GFRα有4種形式，包括GFRα1～4，分別有相應的受體。目前考慮，不僅GDNF/RET在腸道神經節細胞發育過程中有關鍵的作用，而且GDNF/GFRα1也具有非常重要的作用。在敲除RET后，可見GDNF單獨激活感覺神經元的活性；同樣在RET基因缺失表達情況下，有GFRα1表達時，GDNF可以促進神經元的存活，說明GFRα1、GDNF可能還有另外一條途徑來影響神經節細胞發育過程[7]，有待進一步深入研究。所有GDNF參與的過程均可見GFRα1表達，提示GDNF和GFRα1不斷釋放激動信號，通過RET基因傳遞到神經節細胞內，以維持神經節細胞的存活、發育和移行過程。本研究結果證實，在有神經節細胞存在的腸壁內，均存在GDNF、GFRα1、RET表達。

Maurício等[8]研究顯示ARM小鼠模型可見腸道末端神經節細胞密度降低，且功能表達也有所降低；在術中保留的腸管末端是否存在神經節細胞發育不良或神經節細胞缺乏，與其預后密切相關。腸道組織活檢病理檢測神經節密度、神經節大小、神經細胞數量及大小可以客觀反映腸道功能，評價術后生存質量[9]。根據直腸末端神經節細胞及神經叢殘留情況，可以估計保留腸管是否具有正常腸道功能，是否支持患兒術后腸道正常運動，以指導術式選擇、腸管保留，并對評價患兒預后具有重要作用[10]。

本組研究結果顯示中、低位無肛腸壁中神經節細胞相關的神經營養因子的表達高于高位無肛組織，RT-PCR結果亦得出同樣結論，提示患兒神經節細胞的先天發育存在異常。在高位無肛患兒腸壁內發育成活的神經節細胞數量少、形態小。RET、GDNF、GFRα1在腸壁內的表達情況與神經節細胞的分布情況相對應，有神經節細胞存在的腸壁內，免疫組化染色呈現陽性表達，而在直腸末端其表達明顯減低，推測在腸壁內RET、GDNF、GFRα1的表達情況與其神經節細胞分布多少成正比。中、低位無肛神經營養因子的表達明顯好于高位無肛；結合臨床的隨訪結果，提示直腸末端神經營養因子的低表達可能與直腸肛門畸形術后排便功能不良關系密切。高位無肛術后肛門功能不良與神經營養因子的分布降低是否有關還需大樣本研究來證實。在高位無肛的手術過程中，應注意結合臨床和病理檢查結果決定保留其直腸末端的腸管組織，以便術后獲得良好的直腸肛門功能。

Figure 1 Protein expressions of GDNF,GFRα1 and RET圖1 GDNF、GFRα1和RET蛋白表達（SP染色，×400）

[1]Hartman EE,Oort FJ,Aronson DC，et al.Quality of life and disease-specifi c functioning of patients with anorectal malformations or Hirschsprung’s disease:a review[J].Arch Dis Child,2011,96 (4):398-406.

[2] 朱倩儀，詹江華，趙林勝，等.先天性肛門閉鎖直腸遠端神經節細胞及Cajal細胞分布研究[J].天津醫藥，2010，38（6）：486-488.

[3]Burki T,Kiho L,Scheimberg I,et al.Neonatal functional intestinal obstruction and the presence of severely immature ganglion cells on rectal biopsy:6 year experience[J].Pediatr surg Int,2011,27(5): 487-490.

[4]張麗琴，詹江華，谷繼卿.先天性巨結腸GDNF/RET信號傳輸途徑研究進[J].中華胃腸外科雜志，2004，7(1):78-80.

[5]詹江華，牛軍，胡博，等.應用DHPLC篩查先天性巨結腸RET基因突變研[J].天津醫藥，2006，34（8）：519-521.

[6]詹江華，牛軍，胡博，等.應用DHPLC篩查先天性巨結腸GFRα1基因突變研究[J].中華小兒外科雜志，2006，27（11）：p567-569.

[7]詹江華，羅喜榮，胡博，等.倒“Y”字皮瓣在先天性無肛合并會陰瘺手術中的應用及其理論依據[J].天津醫藥，2011，39（12）: 1153-1154.

[8]Maurício M,Martins JL,Meyer KF,et al.Study of the density of ganglion cells in the terminal bowel of rats with anorectal malformations[J].Acta Cir Bras,2007,22(6):441-445.

[9]詹江華，胡博，羅喜榮，等.先天性肛門閉鎖直腸遠端切除范圍的臨床病理研究[J].中華小兒外科雜志,2011，32（2）：154-156.

[10]林虹，朱倩儀，詹江華，等.先天性直腸肛門畸形肛門功能不良的新認知[J].天津醫藥,2011，39（1）:88-90.

（2013-11-04收稿 2014-04-17修回）

（本文編輯 李國琪）

Clinical Significance of GDNF/GFRα1/RET Expression in Distal Rectum with Congenital Anorectal Malformation

ZHANG Hui1,ZHAN Jianghua2
1 Graduate School of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2 Department of Surgery, Tianjin Children’s Hospital

Objective To evaluate the significance and expression of the GDNF/GFRα1/RET genes in distal rectum with Congenital Anorectal Malformations(ARMs)MethodsSpecimens were collected from resected colon which is 3 cm away to the anus and the distal of rectum in 12 ARMs patients.Haematoxylin and Eosin(HE)staining,immunohistochemical (IHC)staining and reverse transcription PCR(RT-PCR)were used to test RET,GDNF and GFRα1 expression in the different site of samples with ARMs.ResultsExpression of ganglia and RET,GDNF and GFRα1 were all negative in distal rectum in 12 ARMs patients.Ganglionic cells were found in tissues 3 cm away from the anus where RET,GDNF and GFRα1 expression were also positive in those ARMs patients.Expression of RET,GDNF and GFRα1 were strong positive in middle and low imperforate anus indicated by brown color and week positive in high imperforate anus indicated by yellow color.One case of faeces contamination and one case of loose motion without anal incontinence were found in post-op follow up of high ARMs patients.By contrast,one case of rectal mucosa prolapse and one case of occasional faeces contamination which recovered with hip bath were found in post op follow up in middle or low ARMs.ConclusionThe unsatisfactory anorectal function is possibly related to the decrease or lost of neurotrophic factors(GDNF/GFRα1/RET)and ganglia in the myenteric plexuses post plastic surgery in ARMs patients.

anus imperforate;glial cell line-derived neurotrophic factors;glial cell line-derived neurotrophic factor receptors;proto-oncogene proteins c-ret;immunohistochemistry;reverse transcriptase polymerase chain reaction

R657.11

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.023

*天津市科委計劃項目（項目編號：10JCYBJC11400）

1天津醫科大學研究生院（郵編300070）；2天津市兒童醫院普外科

△通訊作者 E-mail:zhanjianghuatj@163.com