“雙固一通”電針對老年陽虛模型大鼠淋巴細胞凋亡和促炎因子IL-6、IL-1b的影響

劉建民,王華,毛慧芳,郝青,洪亞群,彭銳,陳澤斌

“雙固一通”電針對老年陽虛模型大鼠淋巴細胞凋亡和促炎因子IL-6、IL-1b的影響

劉建民,王華,毛慧芳,郝青,洪亞群,彭銳,陳澤斌

(湖北中醫藥大學,武漢 430061)

探討“雙固一通”電針治療對老年陽虛模型大鼠脾臟淋巴細胞凋亡和血清促炎因子IL-6及IL-1b的影響。選用SD大鼠,隨機分為正常對照組(NC)、老年陽虛模型組(Model)、“雙固一通”電針組(EA)和電針對照組(EAc)。除NC組外,其余3組大鼠均通過皮下注射D-半乳糖40 d,后繼續肌肉注射氫化可的松7 d,誘導為老年陽虛模型。EA組取關元、后三里和百會穴治療,EAc組取中極、陰陵泉、印堂穴治療。每星期治療6次,共治療4星期。采用Annexin V雙染流式細胞術檢測大鼠脾臟淋巴細胞凋亡率;酶聯免疫吸附法檢測血清中IL-6、IL-1b含量的變化。與NC組相比,Model組大鼠脾臟淋巴細胞凋亡率顯著上升(＜0.01),血清IL-6及IL-1b含量均顯著增高(＜0.01);與Model組相比,EA組和EAc組大鼠上述指標均明顯降低(＜0.01,＜0.05),且EA組上述指標下降更顯著,與EAc組比較,差異具有統計學意義(＜0.05)。電針能明顯降低老年陽虛模型大鼠脾臟淋巴細胞凋亡率和血清中促炎因子IL-6、IL-1b的含量,提示電針對老年陽虛證導致的免疫失衡和炎性因子失衡有治療作用,且“雙固一通”配穴的電針療效優于鄰近對照配穴的療效。

電針;陽虛證;“雙固一通”電針法;細胞凋亡;白細胞介-6;白細胞介素-1b;大鼠

陽虛證為中醫學基本證型之一,陽虛證的發生與個體衰老存在密切關聯[1]。有學者從自然衰老角度切入為研究陽虛證提供了新的思路,有關藥物調控免疫衰老效應及機制在陽虛證的探討方面已有明確研究報道[2-3],而從免疫衰老角度探討針灸方法對老年陽虛證的調控療效及作用機制尚不多見。由王華教授提出的“雙固一通”針灸法以中醫針灸學理論為指導,將固護人體先天之本和后天之本及通瀉病邪作為防治疾病要點,借助針灸作用于人體強壯要穴和阿是穴達到以外治內、固本祛邪目的[4],是針灸穴位配伍應用的新的啟示和參考。近來研究顯示“雙固一通”針灸法在扶助正氣、改善陽虛證方面具有一定的優勢[5-6]。本實驗以D-半乳糖和氫化可的松誘導的老年陽虛模型大鼠為研究對象,從細胞凋亡與促炎因子IL-6和IL-1b含量變化方面探討“雙固一通”電針法對老年陽虛模型大鼠免疫失衡和炎性失衡調控的效應和相關機制,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

FACS Calibur流式細胞儀(美國Becton Dickinson提供);HANS-LH202H型電針儀(北京華運安特科技有限責任公司提供);KDC- 160HR高速冷凍離心機(上海嘉鵬科技有限公司提供);KHB-st360型酶標儀(上海科華公司提供);DH 3600 AB電熱恒溫培養箱(天津)。

胎牛血清由杭州四季青生物科技有限公司提供;RPMI-1640培養基由美國Gibco公司提供; Annexin-V細胞凋亡檢測試劑盒由深圳聯科生物有限公司提供;大鼠IL-6和IL-1b酶聯免疫吸附試劑盒(ELISA)由欣博盛生物有限公司提供。

1.2 實驗分組及造模

5月齡SD健康大鼠40只[華中科技大學同濟醫學院實驗動物學部提供,動物許可證號:SCXK(鄂)2004- 0007],均為雌性,清潔級,體重為(200±20)g,根據簡單隨機排序法分為正常對照組(NC)、老年陽虛模型組(Model)、“雙固一通”電針組(EA)和電針對照組(EAc),每組10只。所有大鼠正常喂養1星期后,開始制作老年陽虛模型,除NC組外,其余各組按每鼠每日125 mg/kg D-半乳糖給予頸背部皮下連續注射40 d,之后再行后腿肌肉注射氫化可的松1.5 mg/100 g連續7 d,NC組大鼠每日皮下注射等量0.9%生理鹽水1次,連續47 d。

1.3 治療及處理方法

NC組采用正常飼養(以下各組略),不進行造模及電針治療。Model組進行造模,不予電針治療。

EA組造模成功后,參照華興邦等制定的《實驗動物穴位圖譜》取關元、后三里和百會,采用蘇州醫療用品廠有限公司出品的0.35 mm×25 mm毫針進行針刺,關元向上斜刺2～3 mm,后三里直刺2～3 mm,百會平刺5 mm。關元和后三里穴接HANS-LH202H型電針儀,選用連續波,頻率2 Hz,強度為1 mA,留針15 min。每日1次,每星期6次,共治療4星期。

EAc組造模成功后,取中極、陰陵泉、印堂,針刺和電針操作同EA組。

NC組與Model組相同方法、相同時間段內抓取固定。各組大鼠治療結束后,禁食24 h,取材,進行相應指標檢測。

1.4 標本采集

腹腔注射10%水合氯醛麻醉,左心室穿刺抽血,用干凈試管收集血液,室溫凝固30 min,3000 r/min離心10 min,收集血清,立即放﹣20℃冷凍保存。采血后,斷頸處死大鼠,立即剖腹取出脾臟,剝離干凈,生理鹽水沖洗備用。

1.5 指標檢測

1.5.1 脾臟淋巴細胞凋亡檢測

脾臟經200目篩網研磨過濾,用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01 mol,pH7.4)洗滌2次,每次1000 r/min各離心10 min取上清,收集細胞。用加入10%胎牛血清的1640完全培養液重懸細胞,以1×結合緩沖液(binding buffer)調整細胞濃度5×106細胞/mL,制備脾臟淋巴細胞懸液。采用流式細胞儀檢測脾臟淋巴細胞百分率。具體步驟為,取100mL樣品,每份樣品加入500mL孵育緩沖液重懸細胞,加入5mL Annexin V -FITC和10mL PI標記溶液;輕微混勻細胞,室溫下避光孵育5 min,流式細胞儀檢測分析。

1.5.2 血清中IL-6和IL-1b表達水平的檢測

采用酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)測定,具體步驟按試劑盒要求進行操作,最后在酶標儀450 nm處測OD值。

1.6 統計學方法

使用SPSS13.0軟件進行統計學處理,所有數據均用均數±標準差表示,采用方差齊性檢驗和單因素方差分析,組間比較采用檢驗。

2 結果

2.1 模型評價

本實驗采用D-半乳糖和氫化可的松誘導制作老年陽虛模型大鼠,是在黃兆勝等[7]制作阿爾茨海默病腎陽虛模型大鼠的啟示下開展的。實驗結果表明,造模后的大鼠表現為拱背蜷曲、肢尾冷、擠臥一起,被毛蓬松、失去光澤,足趾浮腫,舌淡胖苔潤,神疲、少食、反應遲鈍、小便多等虛損狀,根據中醫學陽虛證辨證參考標準[8],類似“陽虛”狀態。

2.2 各組大鼠淋巴細胞凋亡率比較

NC組、Model組、EA組和EAc組淋巴細胞凋亡率分別為12.0%、25.9%、14.4%和21.8%。與NC組相比較,Model組大鼠淋巴細胞凋亡率顯著增加(＜0.01);與Model組比較,經電針處理的EA組和EAc組大鼠淋巴細胞凋亡率均明顯降低(＜0.01,＜0.05);而與EAc組比較,EA組大鼠淋巴細胞凋亡率下降更加顯著(＜0.05);EA組大鼠淋巴細胞凋亡率與NC組比較,差異無統計學意義(＞0.05),而EAc組與NC組比較,差異有統計學意義(＜0.01)。這些結果表明,電針對陽虛證模型大鼠淋巴細胞凋亡率的下降均有拮抗干預作用,但“雙固一通”電針法作用更顯著。各組實驗結果見圖1。

2.3 各組大鼠血清IL-6水平比較

本研究結果顯示,NC組大鼠血清IL-6含量為(111.89±14.50) pg/mL,Model組為(155.88±19.60) pg/mL,EA組為(122.65±13.80) pg/mL,EAc組為(136.65±10.50) pg/mL。Model組大鼠血清IL-6含量高于NC組,兩組比較差異有統計學意義(＜0.01);經電針處理的EA組和EAc組大鼠血清IL-6含量明顯低于Model組(＜0.05,＜0.01);EA組大鼠血清IL-6含量與EAc組比較,差異有統計學意義(＜0.05);EA組大鼠血清IL-6含量與NC組比較,差異無統計學意義(＞0.05);EAc組大鼠血清IL-6含量與NC組比較,差異具有統計學意義(＜0.05)。提示電針能明顯降低陽虛模型大鼠血清IL-6的含量,其中“雙固一通”電針法作用更顯著,優于EA組。

2.4 各組大鼠血清IL-1b水平比較

本研究結果顯示,NC組大鼠血清IL-b含量為(11.21±1.65) pg/mL,Model組為(15.98±1.43) pg/mL,EA組為(12.65±1.34) pg/mL,EAc組為(14.33±1.74) pg/mL。Model組大鼠血清IL-1b含量明顯高于NC組(＜0.05);EA組和EAc組大鼠血清IL-1b含量明顯低于Model組(＜0.05,＜0.01);EA組大鼠血清IL-1b含量與EAc組比較,差異具有統計學意義(＜0.05)。提示老年陽虛大鼠血清促炎因子IL-1b含量增多,電針能明顯降低老年陽虛大鼠血清IL-1b的含量,“雙固一通”電針法療效優于EA組。

2.5 “雙固一通”電針對大鼠脾臟淋巴細胞凋亡率和血清IL-6、IL-1b表達影響的相關性分析

經Spearman相關性檢驗表明,EA組大鼠脾淋巴細胞凋亡率與IL-6水平作相關性分析,=0.751 [0.05(8)=0.632,r0.01(8)=0.765],＜0.05。EA組大鼠脾淋巴細胞凋亡率與IL-1b水平作相關性分析,=0.646,＜0.05。提示“雙固一通”電針治療對陽虛證模型大鼠脾臟淋巴細胞凋亡率的調節與對IL-6及IL-1b表達的影響呈正相關。

3 討論

機體隨增齡出現陽虛質明顯變化[9]為陽虛證的研究提供了依據,機體隨增齡出現免疫功能的進行性下降,使得機體的免疫穩態失衡成為探討陽虛證的重要切入[10]。夏世金等[2-3]把衰老機體免疫失衡和炎性失衡與陽虛證相結合的研究開辟了陽虛證研究的新方向。近來研究表明增齡性陽虛證本質中存在的免疫衰老與衰老進程中促炎性細胞因子的穩態失衡密切相關[3],其中促炎性細胞因子如TNFa、IL-6、IL-1b等細胞因子介導的炎性反應在老年陽虛機體免疫功能衰退或紊亂的發生中起著重要的作用[11-12]。而早在1996年Miller就提出免疫衰老可能與淋巴細胞過度凋亡有關[13],之后該結論無論是在動物還是人體研究中都得到了確切證實[14-15]。因此,從隨增齡免疫功能的進行性下降和慢性促炎性反應進行性升高是否與淋巴細胞過度凋亡有關,對研究陽虛證的發生和針灸干預相關機制十分重要。本研究以D-半乳糖和氫化可的松誘導陽虛模型大鼠,實驗發現,與正常對照大鼠相比,老年陽虛模型大鼠脾臟淋巴細胞凋亡率上升、血清促炎細胞因子IL-6及IL-1b含量增高,由此提示,增齡陽虛證本質中淋巴細胞凋亡與衰老機體的細胞炎性狀態密切相關。

中醫學認為,陽虛證與腎密切相關,腎為先天之本,腎陽為機體之元陽,是生命活動的原動力,臨床很多疾病多與腎陽虛相關,尤以老年人為甚,故開展電針干預陽虛證作用機制對于探討針灸防治以陽虛證為特征的疾病具有積極的意義。本實驗選穴依據王華教授“雙固一通”針法[4]而來,選用具有培腎固本的關元、固護脾胃的足三里和升提陽氣的百會為處方。關元補腎壯陽,承陰經之海之精,歷來為保健強壯、延年益壽之要穴;足三里具有健脾益胃,促氣血生化之源強健,歷來亦為強壯機體之要穴,臨床可治諸虛百損。針刺關元、百會可補腎健脾,腎為先天之本,脾為后天之本,先天與后天相互依賴、相互滋養。百會歸屬督脈,別名“三陽五會”,穴居巔頂,其深處即為腦之所在。三穴合用,共奏強身固本、溫陽散寒之功。

本實驗結果表明,與老年陽虛模型組比較,“雙固一通”電針組淋巴細胞凋亡率降低,血清IL-6及IL-1b表達亦明顯降低(＜0.05,＜0.01)。提示“雙固一通”電針治療對陽虛證模型大鼠脾臟淋巴細胞凋亡率的調節與對IL-6及IL-1b表達的影響呈正相關。為證實“雙固一通”針灸法選穴配伍的獨特優勢,本實驗選取上述關元、足三里、百會三穴的鄰近穴中極、陰陵泉、印堂作為對照,盡管對照治療也取得了一定療效,但對上述指標的影響,“雙固一通”電針組與電針對照組之間比較表現出明顯差異。由此提示“雙固一通”電針法對老年模型大鼠淋巴細胞凋亡率、血清IL-6及IL-1b表達的拮抗干預作用更顯著,效果優于非“雙固一通”針灸法思想指導下的配穴電針療效。這可能與實驗已證實的選用關元、足三里兩穴扶助正氣,固本祛邪、激發人體潛在的抗病能力、延緩衰老作用的穴位特效性有關[16-17]。通過本實驗,我們可以認為“雙固一通”電針法在干預老年陽虛證機制中對免疫衰老和炎性衰老的療效是肯定的,為改善機體陽虛乃至重建機體健康穩態具有重要意義,本實驗從穴位配伍比較研究中探索電針對老年陽虛證的干預療效和機制,為臨床老年性疾病的針灸基本治療方案提供科學依據和借鑒。至于電針通過何種途徑調節淋巴細胞凋亡率和血清促炎因子IL-6、IL-1b,其中的確切機制還有待進一步探討。

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Effect of “Double Reinforcing and One Unblocking” Electroacupuncture on Lymphocyte Apoptosis and Inflammatory Factors IL-6 and IL-1β in a Rat Model of Senile Yang Deficiency

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,430061,

To investigate the effect of “double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture on splenic lymphocyte apoptosis and serum inflammatory factors IL-6 and IL-1β in a rat model of senile yang deficiency.SD rats were selected and randomly allocated to normal control group (NC), senile yang deficiency model group (model), “double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture group (EA) and electroacupuncture control group (EAc). A model of senile yang deficiency was made by 7 days’ intramuscular injection of hydrocortisone following 40 days’ subdermal injection of D-galactose in all the groups of rats except the NC group. Points Guangyuan, Housanli and Baihui were selected in the EA group and points Zhongji, Yinlingquan and Yintang, in the EAc group. Treatment was given 6 times a week for a total of 4 weeks. Rat splenic lymphocyte apoptosis rate was determined using Annexin V double staining flow cytometry. Serum IL-6 and IL-1β contents were measured by enzyme-linked immunoadsorbent assay.Splenic lymphocyte apoptosis rate and serum IL-6 and IL-1β contents increased significantly in the model group of rats compared with the NC group (both＜0.01). The above indices decreased significantly in the EA and EAc groups of rats compared with the model group (＜0.01,＜0.05). The above indices decreased more in the EA group than in the EAc group; there was a statistically significant difference (＜0.05).Electroacupuncture can significantly decrease splenic lymphocyte apoptosis and serum inflammatory factors IL-6 and IL-1β contents in a rat model of senile yang deficiency, suggesting that electroacupuncture has a therapeutic effect on immune imbalance and inflammatory factor imbalance due to senile yang deficiency. The therapeutic effect of electroacupuncture by “double reinforcing and one unblocking” point combination is better than that of electroacupuncture by control adjacent point combination.

Electroacupuncture; Yang deficiency; “Double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture; Apoptosis; Interleukin-6; Interleukin-1β; Rats

1005-0957(2014)01-0066-04

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.01.0066

2013-08-07

湖北省自然科學基金重點項目(2008CDA051)

劉建民(1976 - ),男,副教授,博士

王華(1955 - ),男,教授,博士生導師,研究方向為針灸穴位配伍規律研究,E-mail:Hwang.TCM@china.com