中藥七葉靈顆粒逆轉肺腺癌細胞耐藥機制研究*

董 昀，張 銘△，沙慧芳，楊曉華，金長娟

(1.上海交通大學附屬胸科醫院中西醫結合科，上海 200030;2.上海交通大學附屬胸科醫院腫瘤研究所，上海 200030)

肺癌已經成為全球范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，嚴重威脅人類生命健康，確診后5年生存率僅15%左右。化療是治療肺癌的主要手段之一，而肺癌細胞多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的出現大大降低了其療效[1]，能否有效地逆轉肺癌細胞的MDR已成為影響治療成功的關鍵因素之一。越來越多的研究表明，中藥逆轉腫瘤細胞MDR具有潛在的優勢。中藥七葉靈顆粒是在中醫辨證論治基礎上研制的抗腫瘤藥物。前期研究表明，中藥七葉靈顆粒組方不僅有抑瘤作用，同時還能減輕化療副作用，促進腫瘤細胞凋亡，升高白細胞[2～4]。我們將MDR-1基因導入小鼠Lewis肺癌細胞株(3LL)，建立了能穩定表達P-gP并對泰素、長春生物堿類、鬼臼毒素類藥物具有顯著耐藥性的細胞株(3LL-MDR-1)[5]。在體外實驗中觀察到，中藥七葉靈顆粒對Lewis肺癌耐藥細胞株3LL-MDR-1具有逆轉作用[6～9]。本研究通過體內實驗，利用Lewis肺腺癌細胞(3LL)和Lewis肺癌耐藥細胞(3LLMDR-1)構建裸小鼠皮下移植瘤模型，探討中藥七葉靈顆粒逆轉肺癌細胞耐藥的相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物 中藥七葉靈顆粒組成:生黃芪30 g，黃精30 g，天花粉30 g，女貞子15 g，靈芝15 g，石見穿30 g，七葉一枝花 20 g，山慈菇 15 g，骨碎補30 g，陳皮9g，由上海交通大學附屬胸科醫院生產(滬衛藥劑)。蒸餾水溶解，每毫升含生藥2 g，4℃保存。泰素(Taxol)由施貴寶公司生產，臨時配置為1 mg/ml水溶液。

1.1.2 源細胞株 Lewis肺癌細胞(3LL)、Lewis肺癌耐藥細胞(3LL-MDR-1)為上海市胸科醫院腫瘤實驗室提供。

1.1.3 實驗動物 BALB/C-nu/nu雄性裸鼠80只，6周齡(16±2)g，飼養于上海市胸科醫院腫瘤實驗室實驗中心SPF級動物房，室溫25℃，濕度70%，自由進食與飲水。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 復蘇后的Lewis肺癌細胞(3LL)和Lewis肺癌耐藥細胞(3LL-MDR-1)用含10%FBS的RPMI-1640培養基，在37℃ 5%CO2飽和濕度條件下傳代培養。傳代時，用0.25%的胰蛋白酶消化細胞按1∶3比例傳代。

1.2.2 建立裸小鼠皮下移植瘤模型 將3LL和3LL-MDR-1細胞株擴大培養后，胰酶消化收集細胞。PBS洗滌，調整細胞濃度為10×106/0.1ml，注射于裸鼠右腋部皮下。

1.2.3 動物分組及給藥 造模后的動物按隨機數字表法分為模型組、七葉靈組、化療組和七葉靈+化療組，每類細胞株4組，每組10只。2周后觀察到裸鼠皮下有結節長出后即開始給藥，給藥劑量根據人數體表面積折合法計算。再將每組裸鼠隨機分為A組和B組。A組給藥時間為14 d，B組給藥時間為28 d。

①模型組:生理鹽水0.3 ml每日灌胃1次;A組14 d，B組28 d;②七葉靈顆粒組:七葉靈顆粒0.3 ml(含生藥0.6 g)每日灌胃1次;A組14 d，B組28 d;③化療組:第 1、3、5 天 Taxel溶液 0.5 ml(含Taxel 0.5 mg)腹腔注射，生理鹽水0.3 ml每日灌胃1次;A組14 d，B組28 d;④七葉靈顆粒+化療組:第1、3、5 天 Taxel溶液 0.5 ml(含 Taxel 0.5 mg)腹腔注射，七葉靈顆粒0.3 ml(含生藥0.6 g)每日灌胃1次;A組14 d，B組28 d。

1.2.4 標本制備 實驗各組停藥后第2天，即第15天、第29天脫頸椎處死荷瘤裸鼠，剝離瘤塊、剔除筋膜，置于凍存管內，迅速放入液氮中保存。

1.2.5 各組瘤重和腫瘤抑制率 各組瘤重用電子天平稱重;抑瘤率按下列公式計算:抑瘤率(%)=(模型組平均瘤重－實驗組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.2.6 Real-time Quantitative PCR檢測腫瘤細胞中耐藥相關基因MDR-1、MRP、LRP的mRNA表達 根據試劑盒的操作順序，Total RNA提取和鑒定后合成cDNA。PCR反應各個基因的引物序列及分析條件見下表。混勻后分成3份，每個樣品做3個重復對照。上機擴增檢測。在PCR任意循環中，當熒光強度值大于由儀器自帶軟件計算出的閾值(threshold value，CT)時，樣本被認為陽性，mRNA 表達量用2-△CT表示(2-△CT即比值，△CT由CT值減去GAPDH的CT值)，實驗重復測量3次，取比率的平均值作為最后表達水平。引物序列如下:MDR-1:sense:5'-CTTCACCCAGGCCATGATGT-3'，anti-sense:5'-GGCACCA AA GA CA ACAGCAG-3';MRP:sense:5'-GCGCTGTCTATCGTAAGGCT-3'，anti-sense:5'-AGAGGGGCTGACCAGATCAT-3';LRP:sense:5'-GTATCCCC ATGAGC TGGACG-3'，anti-sense:5'-GCAGAACTTGTTGCAGTGGG-3';GAPDH:sense:5'-GGCAAATTCAACGGCACAGT-3'，anti-sense:5'-GTCTCG CTCCTGG AAG ATGG-3'。

表1 3LL模型各組裸鼠皮下移植瘤瘤重及抑瘤率(s)

表1 3LL模型各組裸鼠皮下移植瘤瘤重及抑瘤率(s)

注:與模型組比較:*P＜0.05;與七葉靈顆粒組比較:△P＜0.05

組別A組(14 d)B組(28 d)例數 瘤重(g)抑瘤率(%)例數 瘤重(g)抑瘤率(%)模型組53.3

1.2.7 Western-blot檢測瘤細胞中耐藥相關基因MDR-1、MRP、LRP的蛋白表達 蛋白質抽提和濃度測定A562，根據標準曲線計算出蛋白濃度。將準備好的樣品和蛋白質marker分別上樣、電泳。取出凝膠，去除所有濃縮膠，將凝膠浸入轉移緩沖液中5 min。準備好膜后，將膜置于反應盒中(印跡蛋白的一面朝上)，加0.5 ml麗春紅染色30 s，觀察轉印效果。去除染液，雙蒸水洗膜3次，每次5 min。在TBST中加入脫脂奶粉至終濃度為5%(w/v)，封閉時，將膜浸入到封閉液中，室溫下振蕩1 h。加入稀釋好的一抗抗體(1∶500)，4℃過夜。TBST洗膜3次(每次5 min)。加入稀釋好的二抗抗體(1∶5000)，室溫1 h振蕩孵育。TBST洗膜3次(每次5 min)。洗好膜以后，取出ECL發光試劑，取A液和B液各1ml混合。將膜放入曝光儀器中，滴加發光液，曝光3次，每次5 min，選擇3次曝光的重疊值。同時以各個細胞蛋白中GAPDH作為內參照，通過與內參照的比較確定MDR-1、MRP、LRP相對表達水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析，以方差分析檢驗各組均數間的差異性，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 七葉靈顆粒對裸鼠皮下移植瘤生長影響

3LL皮下移植瘤模型中，A組(14 d后):七葉靈顆粒組、化療組、七葉靈顆粒+化療組瘤重均低于模型組，差異有統計學意義(P＜0.05)，其中七葉靈顆粒+化療組瘤重最小，抑瘤率為34.5%;B組(28 d后):七葉靈顆粒組、化療組、七葉靈顆粒+化療組瘤重也均低于模型組，差異有統計學意義(P＜0.05)，其中七葉靈顆粒+化療組瘤重最小，抑瘤率為53.3%。

表1、2顯示，3LL-MDR-1皮下移植瘤模型中，A組(14 d后):七葉靈顆粒組、化療組、七葉靈顆粒+化療組瘤重均低于模型組，差異有統計學意義(P＜0.05)，其中七葉靈顆粒+化療組瘤重最小，抑瘤率為34.8%;B組(28 d后):七葉靈顆粒組、化療組、七葉靈顆粒+化療組瘤重也均低于模型組，差異有統計學意義(P＜0.05)，其中七葉靈顆粒+化療組瘤重最小，抑瘤率為23.7%。

表2 3LL-MDR-1模型各組裸鼠皮下移植瘤瘤重及抑瘤率(s)

表2 3LL-MDR-1模型各組裸鼠皮下移植瘤瘤重及抑瘤率(s)

注:與模型組比較:*P＜0.05;與七葉靈顆粒組比較:△P＜0.05

組別A組(14 d)B組(28 d)例數 瘤重(g)抑瘤率(%)例數 瘤重(g)抑瘤率(%)模型組23.7

2.2 七葉靈顆粒對3LL模型中耐藥相關基因MDR-1、MRP和LRP表達的影響

A組(14 d后):七葉靈顆粒組的MDR-1、MRP、LRP基因mRNA表達水平均低于模型組，差異有統計學意義(P值分別為P＜0.01、P＜0.001和P＜0.001);化療組的MDR-1、MRP、LRP基因 mRNA表達水平均低于模型組，差異有統計學意義(P值均為P＜0.001);七葉靈顆粒 +化療組的 MDR-1、MRP、LRP基因mRNA表達水平均低于模型組，差異有統計學意義(P值均為P＜0.001);七葉靈顆粒組、化療組、七葉靈顆粒+化療組的MDR-1、MRP、LRP蛋白表達與模型組比較均下調。

B組(28 d后):七葉靈顆粒組的MDR-1、MRP、LRP基因mRNA表達水平均低于模型組，差異有統計學意義(P值均為P＜0.001);化療組的MDR-1、MRP、LRP基因mRNA表達水平均低于模型組，差異有統計學意義(P＜0.001、P＜0.01和P＜0.05);七葉靈顆粒 +化療組的 MDR-1、MRP、LRP基因mRNA表達水平均低于模型組，差異有統計學意義(P值均為P＜0.001);七葉靈顆粒組、化療組、七葉靈顆粒+化療組的MDR-1、MRP、LRP蛋白表達與模型組比較均下調(圖1、圖2)。

圖1 不同干預對3LL模型MDR-1、MRP、LRP基因mRNA表達的影響

2.3 七葉靈顆粒對3LL-MDR-1模型中耐藥相關基因MDR-1、MRP和LRP表達的影響

圖2 不同干預對3LL模型MDR-1、MRP和LRP基因蛋白表達的影響

A組(14 d后):七葉靈顆粒組和七葉靈顆粒+化療組的MDR-1基因mRNA表達水平明顯低于模型組，差異有統計學意義(P＜0.05);化療組的MDR-1基因mRNA表達水平與模型組比較，差異無統計學意義。七葉靈顆粒+化療組的MRP基因mRNA表達水平低于模型組，差異有統計學意義(P＜0.01);化療組的MRP基因mRNA表達高于生理鹽水，差異有統計學意義(P＜0.05)，七葉靈顆粒組的MRP基因mRNA表達水平與模型組比較，差異無統計學意義。七葉靈顆粒+化療組的LRP基因mRNA表達水平低于模型組，差異有統計學意義(P＜0.01);七葉靈顆粒組和化療組的 LRP基因mRNA表達水平與模型組比較，差異無統計學意義，各組蛋白表達水平的變化與mRNA表達水平變化相一致。

B組(28 d后):七葉靈顆粒組和七葉靈顆粒+化療組的MDR-1基因mRNA表達水平低于模型組，差異有統計學意義(P＜0.01和P＜0.001);化療組的MDR-1基因mRNA表達水平高于模型組，差異有統計學意義(P＜0.01);七葉靈顆粒組和七葉靈顆粒+化療組的MRP基因mRNA表達水平低于模型組，差異有統計學意義(P＜0.05和P＜0.001);化療組的MRP基因mRNA表達水平高于模型組，差異有統計學意義(P＜0.05);七葉靈顆粒+化療組的LRP基因mRNA表達水平低于模型組，差異有統計學意義(P＜0.05);七葉靈顆粒組和化療組的LRP基因mRNA表達水平與模型組比較，差異無統計學意義，各組蛋白表達水平的變化與mRNA表達水平變化相一致(圖3、圖4)。

3 討論

腫瘤的多藥耐藥(MDR)已成為影響腫瘤化療成功與否的關鍵因素[10]。MDR的形成機制非常復雜。目前研究報道顯示，MDR可能與P糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關蛋白(MRP)的表達及活性改變有關[11～14]。同一腫瘤細胞 MDR可能由其中幾種機制共同介導，而化學逆轉劑往往只能針對其中一種機制進行逆轉，因而逆轉效率不高[15];而中藥復方制劑作為耐藥性腫瘤逆轉劑，具備成本低、毒性小、安全范圍大、廣譜性強、作用靶點多等諸多優勢，還可減輕放化療的不良反應[16]，耐藥性腫瘤逆轉劑的研究正越來越受到國內外學者的廣泛關注。

圖3 不同干預對3LL-MDR-1模型MDR-1、MRP、LRP基因mRNA表達的影響

圖4 不同干預對3LL-MDR-1模型MDR-1、MRP、LRP基因蛋白表達的影響

中藥七葉靈顆粒是在中醫辨證論治基礎上研制的抗腫瘤藥物，其組方不僅有抑瘤作用，同時還能減輕化療副作用，增加腫瘤細胞凋亡，升高白細胞[2]。七葉靈顆粒由生黃芪、黃精、天花粉、女貞子、靈芝、石見穿、七葉一枝花、山慈菇、骨碎補、陳皮組成。方中黃芪性味甘溫，善補腎氣。“黃芪……補諸虛不足……益元氣(為腎所藏)”;黃精性味平和，擅長填精，補諸虛……填精髓，“兩者共為君藥;女貞子滋陰養血，天花粉養陰生津，骨碎補強髓堅骨，三藥并用增強生黃芪、黃精之力，同為臣藥;石見穿、七葉一枝花、山慈菇清熱消腫、軟堅散結、驅邪扶正為佐藥;陳皮理氣、健脾、燥濕化痰、調和諸藥為使藥。諸藥共奏補腎填精生髓之功。該藥已在臨床使用10余年，療效可靠，已開展和完成了多項研究，臨床研究顯示其具有良好的抗腫瘤效果，可提高晚期肺癌的生存率、中位生存期、近期療效及生活質量[3，4]。

前期體外研究發現，中藥七葉靈顆粒對Lewis肺癌耐藥細胞株 3LL-MDR-1 具有逆轉作用[6～9]。本研究利用3LL和3LL-MDR-1細胞株制備裸小鼠皮下移植瘤模型，通過體內實驗，進一步研究中藥七葉靈顆粒逆轉3LL-MDR-1細胞的多藥耐藥機制。

隨著實驗的進展我們觀察到，裸鼠皮下出現結節，逐漸增大，甚者出現壞死，并可觀察到裸鼠出現進食減少、消瘦、行動遲緩、喜扎堆、活動減少等，符合惡性腫瘤晚期的臨床表現，尤以模型組更甚。本研究結果顯示，在3LL模型中，藥物干預各組皮下移植瘤的質量、大小明顯小于模型組，抑瘤率尤以七葉靈顆粒+化療組最大，并隨著時間的增加，抑瘤率隨之增加。在3LL-MDR-1模型中，藥物干預各組的皮下移植瘤質量、大小明顯小于模型組，抑瘤率尤以七葉靈顆粒+化療組最大。由此說明，七葉靈顆粒可以有效地抑制腫瘤生長，并可有效地配合化療藥物，對抑制腫瘤生長有協同作用;在腫瘤耐藥的情況下，同樣能夠協同化療藥物起到抑制腫瘤生長的作用。

腫瘤的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是指腫瘤細胞對分子結構不同、作用機制各異的抗腫瘤藥物產生交叉耐藥，是目前所知腫瘤化療失敗的最重要原因[17]。目前研究證實，多數腫瘤多藥耐藥的發生是通過多藥耐藥基因(multidrug resistance 1，MDR1)和多藥耐藥相關蛋白基因(multidrug resistance-associated protein，MRP)以及肺耐藥蛋白基因(lung resistance protein，LRP)編碼的相應蛋白，利用藥泵作用將藥物排出腫瘤細胞外或者改變藥物在細胞內分布而導致耐藥[18]。這3個耐藥基因的過度表達是腫瘤細胞產生多藥耐藥的主要原因，而MDR1的過度表達則被認為是腫瘤多藥耐藥的最重要機制[19，20]。MDR1是具有能量依賴性藥泵功能的跨膜糖蛋白，可主動將進入細胞內的抗癌藥物泵出細胞外，降低細胞內藥物的濃度并產生耐藥[21]。MRP基因編碼表達ATP能量依賴性跨膜糖蛋白泵分子Pgp-190，該蛋白能將疏水性化療藥物逆濃度差泵出細胞外，減少細胞內藥物蓄積，導致耐藥發生。LRP為人的彎隆體主蛋白(MVP)，通過調節囊泡和核質的藥物轉運，將化療藥物儲存于囊泡并減少其在核與胞質間的比例而致耐藥。

在本實驗研究的3LL模型中，藥物干預各組的MDR-1、MRP、LRP呈明顯下調，并與模型組比較差異有統計學意義。且隨著藥物干預時間的增加，七葉靈顆粒組和七葉靈顆粒 +化療組的 MDR-1、MRP、LRP基因表達水平表現出降低趨勢，說明七葉靈顆粒組和七葉靈顆粒+化療組能有效降低多藥耐藥相關基因的表達，防止腫瘤細胞多藥耐藥的產生。而化療組的MDR-1、MRP、LRP基因表達水平呈逐漸升高趨勢，說明隨著時間的增長，腫瘤細胞逐漸對化療產生耐藥性，這也是3LL-MDR-1細胞株產生的基本原理[8，10]。

在3LL-MDR-1模型中，化療組 MDR-1、MRP、LRP基因mRNA及蛋白呈高表達狀態，并隨著治療時間的增加呈逐漸升高趨勢，說明3LL-MDR-1耐藥細胞株存在明顯的耐藥性，并隨著化療時間的增加耐藥性更加明顯，這也與臨床上化療時間越長，腫瘤細胞越易出現耐藥現象相符。治療28 d后，七葉靈顆粒組和七葉靈顆粒+化療組中MDR-1基因和MRP基因的表達明顯較模型組下降，且相較于14 d出現明顯下調，尤以七葉靈顆粒+化療組最為明顯。LRP基因較模型組也出現下調，但未見其隨著時間出現明顯的變化，說明七葉靈顆粒能下調耐藥相關基因表達，并隨著用藥時間的增長，其作用愈加明顯。配合化療藥使用后，其抑制腫瘤及下調耐藥相關基因表達的作用更加明顯，進一步說明七葉靈顆粒具有逆轉化療耐藥、對化療藥物有增敏協同的作用。

本研究結果表明，中藥七葉靈顆粒可逆轉3LLMDR-1細胞的多藥耐藥，其作用機制可能與下調多藥耐藥相關基因MDR-1、MRP和LRP的表達有關。臨床上應用中藥七葉靈顆粒結合化療治療可能抑制化療藥物的多藥耐藥，從而提高化療療效。

[1]Collateral sensitivity as a strategy against cancer multidrug resistance.Pluchino KM，Hall MD，Goldsborough AS，Callaghan R，Gottesman MM[J].Drug Resist Updat，2012，15(1-2):98-105.

[2]崔清，王少墨，郭毅峻，等.“七葉靈”顆粒配合化療治療晚期肺癌臨床研究[J].上海中醫藥雜志，2007，41:14-16.

[3]崔清，金長娟.“七葉靈”顆粒抑制H460細胞生長和轉移作用靶點的實驗研究[J].中國中醫藥現代遠程教育，2009，76:157-160.

[4]金長娟，沙慧芳，趙蘭香，等.七葉靈方誘導裸鼠人肺腺癌A549移植瘤細胞凋亡的實驗研究[J].中西醫結合學報，2004，2:285-288.

[5]沙慧芳，董強剛，蘇建中，等.外源MDR-1基因對小鼠肺腺癌細胞耐藥性產生的影響及機理研究[J].中國肺癌雜志，2000，3:34-38.

[6]沙慧芳，金長娟，蘇建中.中藥七葉靈對耐藥細胞株的逆轉研究[J].腫瘤防治雜志，2002，9:104-106.

[7]楊曉華，沙慧芳，馮久賢，等.人肺腺癌紫杉醇耐藥細胞株的建立及特性研究[J].現代醫學，2009，37:34-37.

[8]孫強玲，楊曉華，魯靜，等.紫杉醇耐藥與敏感細胞的差異表達蛋白分析[J].中國肺癌雜志，2009，12:735-738.

[9]沙慧芳，孫強玲，楊曉華.紫杉醇肺癌細胞BNX動物耐藥模型的建立[J].第二軍醫大學學報，2011，32:1296-1299.

[10]Huang C，Cao P，Xie Z.Relation of promoter methylation of mdr-1 gene and histone acetylation statuswith multidrug resistance in MCF-7/Adr cells[J].Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2009，34:369-374.

[11]LuqmaniYA. Mechanisms ofdrug resistance in cancer chemotherapy[J].Med Princ Pract，2005，14:35-48.

[12]Amiri-Kordestani L，Basseville A，Kurdziel K，et al.Targeting MDR in breast and lung cancer:discriminating its potential importance from the failure of drug resistance reversal studies[J].Drug Resist Updat，2012，15(1-2):50-61.

[13]Lee SK，Shehzad A，Jung JC，et al.Protein kinase Cα protects against multidrug resistance in human colon cancer cells[J].Mol Cells，2012，34(1):61-69.

[14]Zhu WY，Hunag YY，Liu XG，et al.Prognostic evaluation of CapG，gelsolin，P-gp，GSTP1，and Topo-II proteins in nonsmall cell lung cancer[J].Anat Rec(Hoboken)，2012，295(2):208-214.

[15]La Porta CA.Mechanism of drug sensitivity and resistance in melanoma[J].Curr Cancer Drug Targets，2009，9:391-397.

[16]韓碩，敖嫩，林昭靜，等.腫瘤的中藥治療[J].中國實用醫藥，2010，5:158-159.

[17]Eisenhauer EA，Therasse P，Bogaerts J，et al.New response evaluation criteria in solid tumours:revised RECISTguideline(version 1.1)[J].Eur J Cancer，2009，45:228-247.

[18]Li DQ，Wang ZB，Bai J，et al.Reversal of multidrug resistance in drug resistant human gastric cancer cell line SGC7901/VCR byantiprogestin drug mifepristone[J].World J Gastroenterol，2004，10:1722-1725.

[19]Soranzo N， CavalleriGL， WealeME， etal. Identifying candidate causal variants responsible for altered activity of the ABCB1 multidrugresistance gene[J].Genome Res，2004，14:1333-1344.

[20]Ponte-Sucre A.Availability and applications of ATP-binding cassette(ABC)transporter blockers[J].Appl Microbiol Biotechnol，2007，76:279-286.

[21]Baird NJ，Fang XW，Srividya N，et al，Sosnick TR.Folding of a universal ribozyme:theribonucleasePRNA[J].Q Rev Biophys，2007，40:113-161.