津力達對糖尿病大鼠血糖調節激素及胰島細胞功能干預作用研究*

龐 潔，高懷林，王宏濤，魏 聰，吳以嶺△

(1.南京中醫藥大學，南京 210046;2.河北以嶺醫藥研究院(河北省絡病重點實驗室)，石家莊 050035;3.國家中醫藥管理局重點研究室(心腦血管絡病)，石家莊 050035;4.河北醫科大學附屬以嶺醫院，石家莊 050092)

隨著經濟發展及生活方式的改變，2型糖尿病發病率呈現快速增長并已成為嚴重威脅人類健康的主要疾病之一。胰島β細胞分泌的胰島素作為體內惟一的降血糖激素，其分泌不足及作用缺陷一直是糖尿病防治的研究熱點。然而研究發現，胰島α、δ細胞分泌的胰高血糖素、生長抑素及垂體分泌的生長激素與糖尿病血糖調節同樣有著密切關系，并與胰島素相互作用共同參與血糖調控。津力達顆粒是“從脾論治”消渴病(糖尿病)理論觀點指導下研制出的中成藥制劑。臨床及實驗研究表明，津力達具有調節糖脂代謝、改善胰島β細胞功能和胰島素抵抗及保護心腦腎靶器官等作用[1-3]，但關于津力達對血糖調節相關激素及胰島細胞功能作用的研究尚未見報道。本研究旨在通過高脂飲食誘導聯合鏈脲佐菌素腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，觀察糖尿病大鼠血清胰島素、胰高血糖素、生長激素及胰島內分泌細胞功能變化及津力達顆粒干預作用。

1 材料與方法

1.1 動物

48只健康雄性SPF級Sprague Dawley大鼠，體質量220～250 g，購自中國食品藥品檢定研究院(許可證編號SCXK(京)2009-0017)，飼養于河北省中西醫結合醫藥研究院新藥評價中心。動物房分籠飼養，5只/籠，12 h明暗交替，自由進食飲水。

1.2 藥物與試劑

干預藥物:津力達干粉(批號120512，石家莊以嶺藥業股份有限公司)及鹽酸羅格列酮(批號20120202，貴州圣濟堂制藥有限公司)。主要試劑:拜安康血糖檢測試紙(FAD葡萄糖脫氫酶法，德國拜耳)，鏈脲佐菌素(STZ，AMRESCO)，胰島素放射免疫試劑盒(北京華英生物技術研究所)，胰高血糖素ELISA試劑盒(MILLIPORE)，生長激素ELISA試劑盒(MILLIPORE)，小鼠抗大鼠胰島素抗體(Novus biological)，兔抗大鼠胰高血糖素抗體(ImmunoWay)，兔抗生長抑素抗體(SANTA CRUZ)，羊抗大鼠胰多肽抗體(Abcam)，免疫組化SP法試劑盒(北京中杉金橋)。

1.3 主要儀器

拜安康血糖儀，Biofuge primo R高速冷凍離心機(美國索富達)，XD711酶標儀(上海迅達醫療器械公司)，QB-9001微孔板快速振蕩器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)，LeicaDM6000B顯微鏡(德國Leica公司)。

1.4 分組給藥及模型建立

適應性喂養3 d后，正常對照組喂食基礎飼料，其余各組喂食高脂飼料(熱量構成:脂肪59.8%，碳水化合物20.1%，蛋白質20.1%)，每組12只。高脂喂養4周后進行模型建立，造模前日禁食12 h以上，不禁水，腹腔注射STZ 45 mg/kg，造模3 d后尾靜脈取血測定空腹血糖(FBG)≥13.9 mmol/L為造模成功[4]。符合造模成功標準的動物隨機分為正常組(Normal)、模型組(Model)、津力達組(JLD)及羅格列酮組(RSG)4組，按照分組每日分別灌服0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(正常組和模型組)、津力達干粉1.5 g/kg、鹽酸羅格列酮0.67 mg/kg，繼續給予高脂飲食及藥物干預8周。

1.5 指標檢測

1.5.1 空腹血糖、血清胰島素、胰高血糖素及生長激素測定 造模前日禁食12 h以上，不禁水，10%水合氯醛按照0.35 ml/100 g體質量進行麻醉，由腹主動脈取血，全血取出室溫靜置2 h，高速冷凍離心機3500 rpm離心10 min，收集血清樣本并在－20℃低溫冰箱儲存。血清胰島素采用放射免疫法檢測，血清胰高血糖素及生長激素檢測嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.5.2 免疫組織化學法檢測胰島內胰島素、胰高血糖素、生長抑素及胰多肽表達及平均光密度分析 每組選取4只動物，10%中性甲醛固定胰腺組織樣本，石蠟包埋，5 μm切片，每只動物標本不連續切片3張，切片脫蠟至水，微波抗原修復，H2O2室溫20 min，正常羊血清室溫封閉30 min，分別孵育胰島素、胰高血糖素、生長抑素及胰多肽抗體4℃過夜，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，中性樹膠封片。以PBS代替特異性抗體進行陰性對照。每張切片隨機選取5個視野，運用Image-Pro Plus軟件分析并計算陽性表達區域平均光密度。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行單因素方差分析，統計數據以均數±標準差(s)表示，方差不齊用Dunnertt’sT3法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糖尿病大鼠空腹血糖、血清胰島素、胰高血糖素及生長激素變化情況

表1顯示，與正常組比較，模型組大鼠空腹血糖、血清胰高血糖素及生長激素均顯著升高，同時血清胰島素水平顯著降低(P＜0.01)。藥物干預后空腹血糖及血清中各激素水平發生不同程度變化，津力達、羅格列酮干預后空腹血糖、胰高血糖素及生長激素水平降低，血清胰島素水平升高，且與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 各組大鼠空腹血糖、血清胰島素、胰高血糖素及生長激素(s)

表1 各組大鼠空腹血糖、血清胰島素、胰高血糖素及生長激素(s)

注:與正常組比較:#P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 例數 空腹血糖(mmol/L)胰島素(μIU/mL)胰高血糖素(ng/L)生長激素(ng/ml)正 常 組4.37±0.61 23.90±3.30 41.56± 3.31 1.30± 1.00模 型 組 7 29.66±4.20# 14.44±1.67# 67.00±13.64# 59.30±10.11#津 力 達 組 7 22.8±2.01#* 18.14±3.57#* 48.01±12.11#＊＊ 5.15± 1.51＊＊羅 格 列 酮 組 7 22.44±2.33#* 18.06±2.13#* 47.26±5.49#＊＊ 15.40± 4.44 8＊＊

2.2 胰島內分泌細胞免疫組化觀察

免疫組化結果顯示，正常組胰島β細胞分布在胰島中央，胰島素在胰島大部分區域表達，呈深棕色染色(圖1A);模型組中β細胞胞質著色變淺，胰島素表達明顯減少且分布雜亂(圖1B);津力達、羅格列酮組胰島素表達較模型組增多且分布以中心部為多(圖1C、D)。正常組胰島α細胞主要分布在胰島周邊部位(圖2A);模型組α細胞顯著增生，細胞變密集且染色加深，胰高血糖素表達明顯增加(圖2B);津力達、羅格列酮組胰高血糖素與模型組比較表達減少(圖2C、D)。正常組胰島δ、PP細胞數量很少，僅散在分布于胰島周邊(圖2E、I);模型組2種細胞數量均明顯增多，生長抑素及胰多肽表達增加(圖2F、J)，與模型組比較津力達、羅格列酮組生長抑素(圖2G、H)及胰多肽(圖2K、L)表達變化不明顯。

圖1 大鼠胰島β細胞免疫組化染色(DAB×200)

圖2 大鼠胰島α、δ、PP細胞免疫組化染色(DAB×200)

2.3 胰島內分泌細胞陽性表達平均光密度分析

表2顯示，與正常組比較，模型組胰島β細胞分泌的胰島素表達平均光密度顯著降低，胰島α、δ、PP細胞分泌的胰高血糖素、生長抑素及胰多肽表達平均光密度均顯著升高(P＜0.01)。津力達、羅格列酮組胰島素表達平均光密度顯著升高，胰高血糖素表達則明顯降低，且與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。與模型組比較，津力達、羅格列酮組生長抑素表達雖略有升高，胰多肽表達有下降趨勢，但差異均無統計學意義。

3 討論

糖尿病屬于中醫消渴病范疇，既往雖以肺胃腎三消論治，但究其原因皆歸于脾。正如張錫純《醫學衷中參西錄》中曰:“消渴一證，古有上中下之分，謂其證皆起于中焦而極于上下?！逼⒅\化轉輸功能失常，引起機體水液代謝輸布及飲食精微轉輸利用紊亂及不平衡。早在《素問·太陰陽明論》就有“脾與胃以膜相連耳?！敝翉埥橘e《類經·圖翼諸部經穴次序》中認為，脾“形如刀鐮，胃同膜而附其上之左”，這與西醫學中胰腺的解剖位置與形態是基本一致的，并據此認為中醫歷代所論之“脾”包括胰腺在內。而就脾之功能而言，水谷精微經由脾氣轉輸布散至全身，內養五臟六腑、外濡四肢百骸而實現其主運化功能，而這一功能的實現有賴于胰腺外分泌腺分泌的多種消化酶及內分泌腺分泌胰島素、胰高血糖素、生長抑素及胰多肽對水谷精微物質主要成分葡萄糖的利用、合成、貯存及異生，因此認為胰腺是“脾主運化”功能實現的組織結構基礎。津力達顆粒以益脾氣之人參，滋脾陰之黃精、麥冬、葛根，化脾濕之蒼術、佩蘭、茯苓，泄脾熱之苦參、黃連、知母，溫脾陽淫羊藿為主要成分，并佐以祛瘀生新之丹參及調暢氣機之荔枝核，諸藥相合共奏益氣養陰、健脾運津之效，旨在恢復脾(胰腺)主運化水谷精微之功能[5]。

表2 各組大鼠胰島內分泌細胞陽性表達平均光密度分析(s)

表2 各組大鼠胰島內分泌細胞陽性表達平均光密度分析(s)

注:與正常組比較:#P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別α細胞(胰高血糖素)β細胞(胰島素)δ細胞(生長抑素)PP細胞(胰多肽)正 常 組 0.367±0.085 0.404±0.048 0.372±0.090 0.328±0.367±0.123 0.075模 型 組 0.483±0.095# 0.266±0.069# 0.475±0.069# 0.415±0.11#津 力 達 組 0.408±0.047* 0.359±0.070#＊＊ 0.497±0.057# 0.389±0.083羅格列酮組 0.397±0.114＊＊ 0.339±0.081#＊＊ 0.476±0.065#

胰島由4種內分泌細胞組成，其中α、β、δ細胞間存在緊密連接和縫隙連接，形成具有豐富神經和血管聯系的外周細胞單元，內分泌細胞分泌的小分子物質可不經過細胞膜而直接轉運至其他細胞而發生相互作用，并在胰島內形成自身反饋系統，共同參與血糖調節[6]。體內血糖調節主要取決于α細胞和β細胞功能的相互平衡，當胰島β細胞功能障礙引起胰島素分泌絕對或相對不足時，胰島素對胰高血糖素分泌的抑制作用隨血糖濃度的增加而逐漸減弱[7]，表現為胰島組織內α細胞增生及高胰高血糖素血癥;另一方面胰高血糖素分泌增加刺激δ細胞增生，引起生長抑素分泌增加，生長抑素通過抑制胰島細胞對鈣離子的攝取，使細胞內cAMP含量下降，并以旁分泌形式抑制胰高血糖素和胰島素分泌，其中以對胰高血糖素作用為主[8]。PP細胞在胰島組織中分布極少，其分泌的胰多肽具有促進肝糖原分解、抑制胰酶及胃酸分泌等作用。研究發現，糖尿病患者血漿胰多肽水平明顯增高，且胰島PP細胞存在顯著增生[9]。同時有研究證實，減少胰多肽分泌對于改善胰島β細胞功能具有重要作用[10]。除上述胰島細胞分泌的激素外，由垂體前葉細胞分泌的生長激素對血糖調控同樣發揮著重要作用。在糖尿病持續高血糖作用下，由于下丘腦對葡萄糖調節反應能力下降，導致葡萄糖對生長激素的抑制作用減弱，引起其分泌增加[11]。研究表明，生長激素長期升高將導致胰島β細胞功能衰竭及游離脂肪酸增加，從而加重糖代謝紊亂并加速糖尿病及其微血管疾病的發生和發展[12]。綜上，體內糖代謝是在胰島及其他血糖調節激素等多因素共同參與下完成的，隨著2型糖尿病的發生，胰島細胞構成及功能明顯變化，同時由于血糖調節激素異常分泌，勢必加重糖尿病糖代謝紊亂。實驗結果顯示，模型組血清胰高血糖素、生長激素水平顯著升高，胰島素水平顯著下降，并伴隨胰島內胰島素表達顯著減少，胰高血糖素、生長激素及胰多肽表達增加，表明模型組胰島β細胞功能明顯減退，并伴隨α、δ、PP細胞功能紊亂。運用津力達干預后血清胰高血糖素、生長激素水平顯著降低，血清胰島素水平升高，同時增加胰島組織中胰島素表達并減少胰高血糖素表達，但對生長抑素及胰多肽作用不明顯。

綜上所述，津力達顆粒通過調節糖尿病大鼠血清胰島素、胰高血糖素、生長激素等血糖調節激素水平，同時調節胰島細胞分泌功能，從而改善2型糖尿病大鼠糖代謝紊亂。

[1]史婧麗，吳瑩，宋玉萍，等.津力達顆粒對糖尿病大鼠胰島 B細胞的保護作用[J].第二軍醫大學學報，2012，33(4):385-389.

[2]李斐，趙瑛.津力達顆粒對糖尿病大鼠海馬組織的保護作用[J].第二軍醫大學學報，2013，34(2):137-141.

[3]吳瑩，史婧麗，宋玉萍，等.津力達顆粒對糖尿病大鼠腎及心血管組織腎素-血管緊張素系統的影響[J].第二軍醫大學學報，2012，33(010):1065-1069.

[4]Wilson，R. D.， ＆ Islam， M.S.(2012).Fructose-fed streptozotocin-injected rat:an alternative model for type 2 diabetes[J].Pharmacological Reports，64(129)，129-139.

[5]吳以嶺.消渴病從脾論治探討[J].中醫雜志，2002，43(6):410-411.

[6]Unger R H.Glucagon physiology and pathophysiology in the light of new advances[J].Diabetologia，1985，28(8):574-578.

[7]Abdul-Ghani M，DeFronzo R A.Fasting hyperglycemia impairs glucose-butnot insulin-mediated suppression of glucagon secretion[J].Journal of Clinical Endocrinology ＆ Metabolism，2007，92(5):1778-1784.

[8]Farthing M J G.The role of somatostatin analogues in the treatment of refractory diarrhoea[J].Digestion，1996，57(Suppl.1):107-113.

[9]FloydJr J C，Fajans S S，Pek S，et al.A newly recognized pancreatic polypeptide;plasma levels in health and disease[J].Recent progress in hormone research，1975，33:519-570.

[10]Kahleova H，Mari A，Nofrate V，et al.Improvement in β-cell function after diet-induced weight loss is associated with decrease in pancreatic polypeptide in subjects with type 2 diabetes[J].Journal of diabetes and its complications，2012，26(5):442-449.

[11]劉新民.實用內分泌學[M].北京:人民軍醫出版社，1997:772.