新疆伊犁傳統熏馬腸中葡萄球菌的分離及生長特性研究

張雪梅

（伊犁師范大學，新疆伊寧 835000）

熏馬肉和熏馬腸是新疆伊犁哈薩克民族過冬必備的食物，同時因為其口感好、風味好受到了新疆人民的喜愛。熏馬腸通常是由哈薩克人冬宰的馬肉制作而成。取馬肋骨附帶的瘦肉及肥肉切塊后加適量咸鹽至充分吸收，塞入洗凈的馬小腸中，煙熏后懸掛晾干，用木柴火把肉熏干。熏馬腸是新疆伊犁哈薩克族的傳統美食，營養價值很高，風味獨特，廣受新疆各族人民歡迎，近年來更是借助交通與網絡的發展打開了更大的市場[1-2]。

我國研究學者發現，發酵肉制品中的菌株主要包含乳酸菌、葡萄球菌和微球菌，發酵過程中能夠分解肉制品的脂肪和蛋白質，增加肉制品特有的香味[3]。它們在促進風味形成、顏色改善和穩定性、亞硝酸鹽降解、硝酸鹽還原和產品安全方面發揮著獨特的作用[4]。通過篩選出良好的微生物發酵劑可運用于發酵肉制品生產中，能夠穩定發酵肉制品的產品質量。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗材料

購自新疆維吾爾自治區伊犁哈薩克自治州的熏馬腸。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、瓊脂、乳糖、蛋白胨、D-甘露醇、氯化鈉、酚紅、HCl溶液和NaOH溶液。

1.1.3 主要儀器

GSP-9080MBE隔水式恒溫培養箱，上海博源實業有限公司；ZQLY-180N振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；G型玻璃儀器氣流烘干器，鄭州長城科工貿有限公司；722S可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；SX-500立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；FA2104N型電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司；G80D23CN2P微波爐，佛山市順德區格蘭仕微波爐電器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；微量移液器。

1.2 實驗方法

1.2.1 取樣與樣品處理

本試驗選取伊犁熏馬腸作為實驗對象，按照食品分析取樣方法進行取樣，用實驗室透明真空自封袋封裝好，以無菌的方式取樣25 g，加入225 mL無菌生理鹽水中，使用食品均質器拍打30 min，此時為稀釋度10-1的樣品液，充分攪拌后靜置；依次進行10倍梯度稀釋獲得10-2、10-3、10-4和10-5稀釋液備用。

1.2.2 分離目標優勢菌及培養

固體高鹽甘露醇瓊脂（Manitol Salt Agar，MSA）選擇培養基的配方：牛肉浸膏1.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉75.0 g，D-甘露醇10.0 g，酚紅0.025 g，瓊脂13 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調制為7.2～7.6。

將提前準備好的10-3、10-4、10-5稀釋液分別涂布在倒好的MSA選擇培養基上，37 ℃條件下培養48 h。挑取表面為白色、光滑、圓形的菌落，重復劃線3～4次得到純菌落。

1.2.3 葡萄球菌的初篩

通過MRS培養基選擇分離出的目標優勢菌，做革蘭氏染色，過氧化氫酶檢測，選取革蘭氏陽性、過氧化氫酶陽性球菌。將細菌于液態培養基中37 ℃培養24 h后，涂布于MSA固態培養基上，將新生霉素藥敏紙片粘貼于培養皿上，經37 ℃ 24 h后觀察，做新生霉素敏感試驗，如形成抑菌圈則表示該菌株為凝固酶陰性葡萄球菌株[5]。

1.3 菌株生物學特性分析

1.3.1 MSA液體培養基配制

MSA液體培養基配方：牛肉浸膏1.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉75.0 g，D-甘露醇10.0 g，酚紅0.025 g，瓊脂13.0 g。蒸餾水1 000 mL，pH值調制為7.2～7.6。

1.3.2 pH值對菌株生長的影響測定

通過用酸堿溶液調整MSA液體培養基的pH值，分別調節pH值為6.0、7.0、8.0。向液體培養基中接種分離培養的葡萄球菌，放于37 ℃的振蕩培養箱培養48 h，測定600 nm處的吸光值，以MSA液體培養基為空白對照。

1.3.3 NaCl濃度對菌株生長的影響測定

用氯化鈉將MSA液體培養基的鹽濃度分別調節為5.5%、9.5%、11.5%，以鹽濃度為7.5%的自然培養作為對照。MSA液體培養基中接種分離培養的葡萄球菌，各留1支做空白試驗，放于37 ℃培養箱培養48 h，在波長為600 nm處測量吸光值，以MSA液體培養基為空白對照。

1.3.4 亞硝酸鹽濃度對菌株生長的影響測定

用亞硝酸鹽藥品將MSA液體培養基的亞硝酸濃度濃度分別調節為 50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1，以亞硝酸濃度0 mg·L-1的自然培養作為對照。MSA液體培養基中接種分離純化的葡萄球菌，放于37 ℃培養箱培養48 h，在波長為600 nm處測量吸光值，以MSA液體培養基為空白對照。

2 結果與分析

2.1 葡萄球菌的分離

將MSA選擇培養基中的菌株進行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗，篩選革蘭氏陽性菌，球形菌，無芽孢，過氧化氫酶陽性菌株。將篩選出的菌株做新生霉素抗性試驗，將篩選出的菌株培養24 h后涂布于MSA固體培養皿，將新生霉素藥敏試紙置于培養皿表面，37 ℃培養24 h，觀察發現菌株周圍形成抑菌圈，抑菌圈＞16 mm，表明該菌株對新生霉素敏感，從而判定該菌株為葡萄球菌。

2.2 pH值對菌株生長的影響

通過實驗發現不同pH值下熏馬腸中的葡萄球菌生長趨勢不甚相同。從實驗中可分析出該葡萄球菌株具有一定的耐酸性，將MSA液體培養基放于37 ℃的恒溫振蕩培養箱中培養48 h，發現在pH為6的MSA液體培養基酸性環境中，通過測試600 nm處的吸光值為1.4，菌株生長情況顯著高于MSA液體培養基為中性及堿性環境，即pH值為6時葡萄球菌仍能正常生長，該菌株具有一定的耐酸性（圖1）。

圖1 不同pH值條件下葡萄球菌生長情況

2.3 NaCl對菌株生長的影響

通過實驗發現NaCl的濃度影響熏馬腸內葡萄球菌生長情況（圖2），圖中可看出葡萄球菌的生長隨NaCl濃度的增加而逐漸受到抑制，說明濃度為5.50%時有利于葡萄球菌的生長。食鹽在發酵肉制品中能抑制細菌的滋生，因此發酵劑需具備耐鹽性。

圖2 不同鹽濃度條件下葡萄球菌生長情況

2.4 亞硝酸鹽對菌株生長的影響

在肉制品的制作過中添加亞硝酸鹽可抑制肉毒梭菌的生長和發育，改善產品的顏色，形成腌肉特有的味道。能否耐受一定量的亞硝酸鹽是選擇發酵劑菌種的決定性因素，因為這是一個重要的先決條件。由圖3可看到葡萄球菌的生長有耐亞硝酸鹽的特性，亞硝酸鹽濃度為150 mg·L-1時葡萄球菌生長情況良好。說明對于葡萄球菌具有一定程度的耐亞硝酸特性，因為熏制肉制品中一般都添加一定量的亞硝酸鹽，目的是為了更好地保持發酵肉制品的色澤，說明該菌株具有一定的耐亞硝酸鹽特性。

圖3 不同亞硝酸鹽濃度下葡萄球菌生長情況

3 結論

本研究從購自伊犁州本地的熏馬腸中利用微生物選擇培養分離方法分離出優勢菌葡萄球菌。菌株生物學特性分析研究結果顯示，葡萄球菌有一定的耐酸性；隨著NaCl濃度的增加，葡萄球菌的生長逐漸受到抑制，NaCl濃度為5.50%的情況下菌株生長旺盛；發酵菌株具有耐亞硝酸鹽特性是發酵劑的基本要求，實驗結果表明分離得到的葡萄球菌具有耐亞硝酸鹽特性。本實驗結果表示，熏馬腸中優勢菌種葡萄球菌符合優良微生物發酵劑的生長特性要求，為進一步研究熏馬腸中的發酵菌株奠定了理論基礎。