Alzheimereimer患者血清中含有低水平及低親和力的抗A Aβ 自身抗體

段金海，徐書(shū)雯，莫建偉，肖豪，莫思杰，胡濤

臨床研究

Alzheimereimer患者血清中含有低水平及低親和力的抗A Aβ 自身抗體

段金海1，徐書(shū)雯1，莫建偉1，肖豪1，莫思杰2，胡濤2

1廣東省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科//廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院//廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所//廣東省神經(jīng)科學(xué)研所，廣東廣州510080；2廣東省南海福利中心，廣東佛山528226

目的研究AD病人血清中Aβ自身抗體的特性及對(duì)老年斑的親和力。方法選擇AD、血管性癡呆（vascular dementia,VD）患者及正常老年人做為研究對(duì)象，采集血清標(biāo)本，測(cè)定抗體含量，并親和純化抗體進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果AD患者血清中含有低水平的Aβ自身抗體，但抗體含量與性別、年齡和MMSE評(píng)分沒(méi)有相關(guān)性；AD體內(nèi)的抗體不能識(shí)別Tg2576鼠腦內(nèi)的老年斑。結(jié)論Aβ自身抗體的降低是AD病人特有的免疫低反應(yīng)性所致；Aβ自身抗體與老年斑的親和力明顯降低；這些抗體的病理生理作用需要進(jìn)一步研究。

阿爾茨海默病；血管性癡呆；抗Aβ自身抗體

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease,AD）是以進(jìn)行性加重的記憶認(rèn)知功能減退為主要臨床特點(diǎn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理特征為老年斑（senile plaques,SPs）及神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles,NFTs）。β-淀粉樣蛋白（amyloid β-peptide,Aβ）具有神經(jīng)毒性，其在腦內(nèi)的生成增多及異常聚集是AD發(fā)病的關(guān)鍵因素。研究認(rèn)為Aβ在體內(nèi)可以誘導(dǎo)出抗Aβ自身抗體，因?yàn)閺撵o脈用免疫球蛋白可以分離出抗Aβ自身抗體［1］，并且可從人類(lèi)B細(xì)胞克隆出Aβ抗體［2］。流行病學(xué)調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，與正常人相比AD患者的血清和腦脊液含有低滴度的Aβ自身抗體［3］。但是這些自身抗體的病理生理作用仍然不清楚。在AD轉(zhuǎn)基因鼠和Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，Aβ1-42疫苗可以誘導(dǎo)出特異性的Aβ抗體，并顯示出良好的免疫原性和安全性［4］，但在Ⅱa期臨床試驗(yàn)（AN1792）中，6％的受試者出現(xiàn)了無(wú)菌性腦膜腦炎［5］。目前認(rèn)為，腦炎的發(fā)生與Aβ1-42全肽及佐劑QS21'導(dǎo)致的Th1'細(xì)胞免疫反應(yīng)有關(guān)［6］。因此，在把免疫療法做為AD的預(yù)防和治療措施之前，有必要對(duì)AD患者體內(nèi)的Aβ自身抗體進(jìn)行細(xì)致的研究。本課題試圖分析AD患者抗Aβ自身抗體的特性并在體外觀察抗體與老年斑的接合能力。

1 材料和方法

1.1 受試對(duì)象

從2004年4月~2013年9月，選取廣東省南海福利中心、廣東省人民醫(yī)院、廣州市老人院以及中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院的住院的AD、血管性癡呆（vasculardementia,VD）患者及正常老年人（healthy controls, HC）做為研究對(duì)象。AD入組標(biāo)準(zhǔn):（1）符合美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病學(xué)傳染病及中風(fēng)研究所與阿爾茨海默病和相關(guān)病協(xié)會(huì)（NINCDS-ADRDA）的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）Loeb改良缺血量表評(píng)分均小于4分；（3）排除其他原因所致癡呆；（4）患者視、聽(tīng)力及精神狀態(tài)允許合作完成神經(jīng)心理學(xué)測(cè)試。VD入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有腦梗死或腦出血病并經(jīng)腦CT或MRI確診；（2）癡呆，符合美國(guó)精神病學(xué)會(huì)的《精神障礙診斷及統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》第四版修訂版(DSM-Ⅳ-R) VD的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（3）卒中3個(gè)月后發(fā)生癡呆，病程超過(guò)3個(gè)月，且認(rèn)知功能呈突然或階梯性下降（4）Hachiski評(píng)分≥7分；（5）排除失語(yǔ)及卒中前有認(rèn)知功能障礙者。正常對(duì)照組系普外科及骨科非神經(jīng)系統(tǒng)疾病者，沒(méi)有記憶認(rèn)知功能下降病史及澘在影響記憶認(rèn)知功能的疾病。研究對(duì)象的臨床特征見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 血清標(biāo)本的收集和處理清晨空腹采血，裝入無(wú)菌試管，不加抗凝劑，室溫靜置30 min后，1000 g，4℃，離心10 min。上清分裝入另外一支無(wú)菌管，－70℃保存。

1.2.2 ELISA采用間接ELISA法檢測(cè)，Aβ42濃度（10 μg/孔）包被96孔聚苯乙烯反應(yīng)板（Greiner公司），每孔100μl，4℃孵育過(guò)夜。3％小牛血清37℃封閉2 h。加入倍比稀釋的血清樣品（從1∶10開(kāi)始稀釋?zhuān)＿^(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗人IgG（武漢博士德公司），1∶2 000稀釋?zhuān)靠?00 ml，37℃孵育40 min，洗滌。TMB顯色，2M H2SO450 ml中止，于波長(zhǎng)450 nm下測(cè)定每孔A值，以樣本孔吸收值比空白孔吸收值之比大于2.1為陽(yáng)性。單克隆抗體8G7（Calbiochem,USA）作為陽(yáng)性對(duì)照，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 抗體純化33％和50％飽和硫酸銨鹽析：按常規(guī)方法進(jìn)行［7］。溴化氰(CNBr)活化的Sephrose 4B柱層析：按試劑說(shuō)明書(shū)操作，即取1.5 g CNBr-activated Sephrose 4B凍干粉，溶脹、重懸后，與4 mg的Aβ42蛋白混合,封閉、洗滌后裝柱。以50 ml PBS（pH 7.4）平衡柱（流速，60 ml/h），加入鹽析的粗提的IgG，用洗脫液（50 mmol/L HCl-甘氨酸緩沖液，pH分別為2.5和1.5交替進(jìn)行）洗脫，出峰時(shí)收集流出的組分，用碳酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至中性，透析48 h，于4℃保存。純化效果采用15％SDS-PAGE進(jìn)行分析。

1.2.4 Western blot參照李少兵等［8］的方法，標(biāo)準(zhǔn)品為GST-Aβ42融合蛋白，Mr約為30 000。加樣時(shí)，每孔10 μl(含Aβ42 20 μg)，恒壓120 V電泳。卸膠、清洗及裝架后，恒流50 mA電轉(zhuǎn)90 min。取出PVDF膜經(jīng)雙蒸水洗滌、3％BSA封閉和TBST洗滌后，依次加入1∶100純化的樣品和1∶2 000的HRP-羊抗人IgG，室溫孵育2 h，上述兩步后分別用TBST洗滌5次，時(shí)間分別為1、2、 3、4、5 min。DAB顯色。以小鼠抗人Aβ42mAb（8G7）作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.5 免疫組織化學(xué)Tg2576鼠腦石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，抗原修復(fù)。染色按SABC法并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。純化抗體的稀釋度為1∶100。以小鼠抗人單克隆Aβ1-42抗體作陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析全部數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0分析。

2 結(jié)果

用ELISA方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常人、VD和AD病人血清中都出現(xiàn)抗Aβ自身抗體，但相比正常人和VD，AD患者的抗體含量明顯減少，而VD和HC組則沒(méi)有顯著性差異（表1）。AD的抗體含量與性別、年齡及MMSE評(píng)分都沒(méi)有相關(guān)關(guān)系。在VD和HC組，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性。Western blot分析顯示，AD、VD及HC的純化Aβ自身抗體及小鼠抗人Aβ42mAb在Mr為30 000處有蛋白結(jié)合帶，與GST-Aβ42融合蛋白質(zhì)的結(jié)合位置相符合（圖1）。免疫組化染色結(jié)果顯示，三組研究對(duì)象的純化抗體均不能與Tg2576鼠腦內(nèi)的Aβ斑塊結(jié)合。

表1 研究對(duì)象臨床特征簡(jiǎn)表(Mean±SD)

圖1 Western blot檢測(cè)血清Aβ自身抗體

3 討論

與以往結(jié)果［8-9］相似，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AD患者及正常人血清中含有抗Aβ自身抗體，而與正常人相比，AD患者的抗體含量顯著降低。雖然VD與AD有不同的病理機(jī)制，但是在其血清中也發(fā)現(xiàn)了抗Aβ自身抗體，且與正常人相比無(wú)差異，而比AD患者則顯著升高。用Westernblot方法發(fā)現(xiàn)，純化的抗體均可檢測(cè)到GST-Aβ42融合蛋白。但是AD患者的抗體含量與性別、年齡及MMSE評(píng)分沒(méi)有相關(guān)性。雖然隨著年齡的增加，老年人的免疫反應(yīng)呈下降的趨勢(shì)，但是AD患者Aβ自身抗體含量的降低與老年人總體免疫反應(yīng)水平下降無(wú)相關(guān)性［10］。因此這些結(jié)果提示，Aβ自身抗體的降低是AD病人特有的免疫低反應(yīng)性所致。Monsonego等［11］也觀察到了相似的結(jié)果，用Aβ肽接種APP轉(zhuǎn)基因鼠和野生鼠，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因鼠誘導(dǎo)出的Aβ抗體水平明顯低于野生鼠。轉(zhuǎn)基因鼠及AD病人的T淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)也發(fā)現(xiàn)，Aβ肽誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)較非轉(zhuǎn)基因鼠明顯降低［12-13］，認(rèn)為這可能是由于T細(xì)胞對(duì)Aβ肽產(chǎn)生耐受，導(dǎo)致對(duì)B細(xì)胞的輔助作用下降，不足以產(chǎn)生足夠的和有效的抗體以清除體內(nèi)的Aβ，從而導(dǎo)致老年斑的形成。

從血清中純化的Aβ自身抗體是多克隆性的，可能含有大量的與Aβ肽有不同親和力的抗體［14］。雖然Du等［14］用免疫沉淀法證明親和純化的Aβ自身抗體能與人工合成的可溶性的Aβ肽結(jié)合，但是這些抗體能否和含有大量不溶性Aβ且具有β折疊結(jié)構(gòu)的老年斑結(jié)合，沒(méi)有進(jìn)一步探索。本實(shí)驗(yàn)分別用AD、VD及HC血清的純化抗體與T g2576鼠的腦片孵育，發(fā)現(xiàn)AD、VD和HC的抗體均不能識(shí)別腦片中的老年斑，顯示出與老年斑的低親和力。因此推測(cè)AD病人的體內(nèi)很可能存在產(chǎn)生Aβ自身抗體的特異性的免疫機(jī)制異常。這些抗體雖然可以結(jié)合可溶性的Aβ肽，但是卻不能識(shí)別老年斑。目前有研究認(rèn)為人體（包括各個(gè)年齡組的正常人群[15]）內(nèi)出現(xiàn)的Aβ抗體并不是針對(duì)老年斑而是針對(duì)外周Aβ，如血小板產(chǎn)生的Aβ［6］，因此可以理解這些抗體并不能特異性的識(shí)別老年斑。

用Aβ肽或Aβ單克隆抗體接種AD轉(zhuǎn)基因鼠都可以導(dǎo)致鼠腦內(nèi)Aβ的減少及老年斑的清除［17］。其機(jī)制可能有抗體抑制Aβ折疊結(jié)構(gòu)的形成、增加Aβ纖維的解聚并激活小膠質(zhì)細(xì)胞清除Aβ［18］，以及通過(guò)外周降解可溶性的Aβ肽從而使中樞和外周的Aβ平衡破壞，使中樞內(nèi)的Aβ流向外周，達(dá)到清除腦內(nèi)Aβ的目的［19］。但是在AD病人體內(nèi)，自身抗體的病理生理作用仍然不清楚。這些低水平、低親和力的抗體是否通過(guò)外周降解途徑降解Aβ還是有別的作用機(jī)制或臨床意義仍然需要進(jìn)一步研究。

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Reduced low-affinity anti-β-amyloid autoantibodies in serum from Alzheimer’s disease

DUAN Jinhai1,XU Shuwen1,MO Jiannwei1,XIAO Hao1,Mo Sijie2,HU Tao21Neurology Department,Guangdong General Hosptial(Guangdong Academy of Medical Sciences).Guangdong Institute of Geriatrics.Guangdong Institute of Neurosciences,Guanzhou 510080,China;2Nanhai welfare centre,Nanhai City,foshan 528226,China

ObjectiveTo investigate the characterization of anti-Aβ autoantibodies in AD patients and affinity ability of autoantibodies stainning the Aβplaques in vitro.MethodsELISA was performed to detect levels of naturally occuring anti-Aβautoantibodies in surum from AD patients,vascular dementia and age-macthed healthy controls.Immunohistochemistry assay was employed to confirm the affinity abillity of anti-Aβautoantibodies stainning the Aβ plaques in vitro.ResultsNaturally occuring anti-Aβautoantibodies in surum from AD patients was significantly lower than those from vascular dementia and healthy controls.The autiantibodies levels were independent of gender,age and MMSE scores in AD patients. Autoantibodies purified from healthy individuals and vascular dementia patients could readily stain the Aβplaques in transgenic mouse Tg2576,while those from AD patients could not.ConclusionCompared with vascular dementia and healthy controls,AD patients have obviously lower anti-Aβautoantibodies which could not stain Aβplaques in transgenic mouse and showed a low-affinity ability with Aβplaques in vitro.The petential pathophysiological function of autoantibodies in AD patients needs futher study.

Alzheimer's disease;Vascular dementia;anti-Aβ autoantibody

2014-05-23

廣東省自然科學(xué)基金（7300973，S2012010009108）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)（2010B031600167）

段金海，副主任醫(yī)師，博士，電話：020-83827812-70711，E-mail: duanjh888@hotmail.com