探討3種痰TB-DNA提取方法在肺結核診斷中的應用價值

劉振專 蔡常輝 黃 貞 陳述文

（中山市第二人民醫院檢驗科，廣東 中山 528447）

探討3種痰TB-DNA提取方法在肺結核診斷中的應用價值

劉振專 蔡常輝 黃 貞 陳述文

（中山市第二人民醫院檢驗科，廣東 中山 528447）

目的優選肺結核診斷中理想的痰TB-DNA提取方法。方法選擇我院肺科門診肺結核患者185例，提取其痰液樣本，應用煮沸裂解法、酚/氯仿法、以及進口離心柱法進行分析，對比實時熒光PCR結果。結果進口離心柱法下TB-DNA陽性檢出率為81.08%（150/185），明顯高于煮沸裂解法以及酚/氯仿法，P＜0.05。結論在對疑似肺結核患者痰液標本進行檢測中，可優先選擇進口離心柱法作為TB-DNA的有效提取方法。

肺結核；診斷；TB-DNA

臨床疑似肺結核患者實驗室診斷的關鍵在于對痰液標本中的TB復合體進行檢測與分析[1]。由于TB結核分歧桿菌具有耐酸耐酶的特點，故而對DNA提取來說有一定特殊性，不同提取機制以及提取步驟干預下，會造成PCR擴增效果出現差異[2,3]。為合理優選在肺結核診斷中理想的痰TB-DNA提取方法，本文以185例肺結核患者為研究對象，分別應用煮沸裂解法、酚/氯仿法、以及進口離心柱法以上3種方法進行干預，取得了確切結論，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇我院自2013年7月至2013年12月期間，肺科門診疑似肺結核患者共計185例作為研究對象，提取其痰液樣本進行研究，對臨床資料展開回顧分析。185例患者均最終確診為肺結核。其中，男性患者為120例，女性患者為65例，患者年齡在40～70周歲范圍內，平均年齡為（56.1±2.5）歲。

1.2 方法：在對185例患者痰液標本進行預處理后，分別使用煮沸裂解法、酚/氯仿法、以及進口離心柱法對痰液標本中DNA進行提取，具體操作方法如下。

1.2.1 煮沸裂解法：使用TB核酸擴增PCR熒光檢測試劑盒中所自帶的DNA提取液進行DNA提取工作。提取液主要成分為Tris鹽酸緩沖液以及去污液。將患者痰液標本在經過預處理環節操作后所得到的沉淀每管加入劑量為50.0 μL的DNA提取液，充分混合均勻，在100.0 ℃溫度條件下進行持續加熱（加熱時間為10.0 min），完成加熱后將其轉至室溫狀態進行離心處理（離心條件為13000 r/min，持續5.0 min），完成離心處理后在-30.0 ℃條件下保存備用。

1.2.2 酚/氯仿法：自行配置細胞裂解液（配置方法為：10.0 mmol/L劑量Tris鹽酸緩沖液、乙二胺四乙酸、生理鹽水，以及十二烷基硫酸鈉與1.0 mmol/L劑量氫氧化鈉充分混合）。將患者痰液標本在經過預處理環節操作后所得到的沉淀每管加入劑量為300.0 μL的細胞裂解液，充分混合均勻，在100.0 ℃條件下進行加熱，持續時間為15.0 min。采取酚/氯仿法對DNA進行純化，加入等體積氯仿/異戊醇（標準比例為24/1），離心處理（離心條件為10000 r/min，持續5.0 min），取上層清液，將其轉移至等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（標準比例為25/24/1）試管中，離心處理（離心條件為10000 r/min，持續5.0 min），再次將上層清液轉移至新試管，加入等體積異丙醇，顛倒混合，離心處理（離心條件為10000 r/min，持續5.0 min）。棄置上層清野后，加入1000.0 μL劑量無水乙醇進行洗滌并離心（離心條件為10000 r/min，持續1.0 min），棄置上層清液，最后將沉淀DNA溶解于50.0 μL劑量雙蒸水中，完成處理后在-30.0 ℃條件下保存備用。

1.2.3 進口離心柱法：將患者痰液標本在經過預處理環節操作后所得到的沉淀加入劑量為100.0 μL的試劑盒緩沖液ATL（試劑盒選擇為QIAamp DNA mini kit），充分振蕩并使其產生懸浮。后進行點動離心處理，加入20.0 μL計量的蛋白酶K，溫箱培育（溫度為56.0 ℃，持續30.0 min），并點動離心處理，后加入200.0 μL劑量緩沖液AL，振蕩15 s并充分混合，溫箱培育（溫度為70.0 ℃，持續 10.0 min），并點動離心處理，后加入200.0 μL劑量無水乙醇，振蕩15 s并充分混合，點動離心后將溶液轉移至離心過濾柱中進行離心處理（離心條件為8000 r/min，持續1.0 min），棄濾過夜，將離心過濾柱轉移至新收集管內。進一步加入500.0 μL劑量緩沖液AW1，同等條件離心后將離心過濾柱再次轉移至新收集管，加入500.0 μL劑量緩沖液AW2，13000 r/min離心，持續3.0 min，棄置濾過液，再次將離心過濾柱轉移至新收集管并做1.0 min離心處理，最后將200.0 μL劑量洗脫緩沖液AE通過懸空的方式向吸附膜中間位置加入，室溫條件下靜置2.0 min，8000 r/min條件做2.0 min離心處理，最后收集離心管內液體并保存備用。

1.3 觀察指標：在FQ-PCR儀器（中山大學達安基因股份有限公司生產的DA-7600）支持下，完成對樣本的TB核酸擴增PCR熒光檢測工作。根據熒光曲線形態對檢測結果進行評估，評價3種痰TB-DNA提取方法的實時熒光PCR結果并進行對比。

1.4 數據處理：使用SPSS 17.0軟件進行分析，計數資料以%表示，以χ2檢驗，當P＜0.05時為差異顯著，且具有統計學意義。

2 結 果

進口離心柱法下TB-DNA陽性檢出率為81.08%（150/185），明顯高于煮沸裂解法以及酚/氯仿法下TB-DNA陽性檢出率，數據對比存在顯著差異，P＜0.05，具有統計學意義。見表1。

表1 3種痰TB-DNA提取方法檢測結果對比表

3 討 論

痰液標本在提取DNA中最主要的難點在于：標本中有大量的干擾物以及雜志，DNA抽提期間容易出現抑制物共純化的問題，導致下游PCR擴增受到影響。本次研究中發現：煮沸裂解法雖應用時間較長，操作簡單，但提取TB-DNA中純度較低，無明顯優勢，改進后的酚/氯仿法雖然能夠對痰液中多多糖以及色素成分進行去除，但操作復雜要求較高，可行性不足，而進口離心柱法有效避免了以上問題，且PCR效果良好，質量穩定，擴增效果確切，能夠在實驗室診斷中加以推廣，值得重視。

綜上所述，在對疑似肺結核患者痰液標本進行檢測中，可優先選擇進口離心柱法作為TB-DNA的有效提取方法。

[1] 李素華,陳莉,王歡,等.腦脊液中TB-DNA實時熒光定量PCR分析的臨床應用價值評價[J].西南國防醫藥,2010,20(6):641-642.

[2] 周華,楊春,杜煦,等.胸水ADA、TB-DNA聯合檢測在結核性胸膜炎中的診斷運用[J].臨床肺科雜志,2012,17(6):1066-1067.

[3] 張玉平,丁顯平,張麗媛,等.T-SPOT.TB、痰涂片和TB-DNA檢測在肺結核診斷中的比較研究[J].成都醫學院學報,2013,8(1):49-51.

Application Value of Study on Extracting Method of Three Kinds of TB-DNA in Sputumin the Diagnosis of Pulmonarytuberculosis

LIU Zhen-zhuan, CAI Chang-hui, HUANG Zhen, CHEN Shu-wen
(Department of Laboratory, the Second People's Hospital of Zhongshan City, Zhongshan 528447, China)

ObjectiveTo select ideal in tuberculosis diagnosis sputum TB-DNA extraction method.Method185 cases with pulmonary outpatient tuberculosis patients choose our hospital, extract sputum samples, the application of boiling pyrolysis method, phenol/chloroform method, column and import the centrifugal method were analyzed, and compared the real-time fl uorescent PCR results.ResultsUnder import centrifugal column method TB-DNA positive detection rate was 81.08%(150/185), signif i cantly higher than the boiling cracking method and phenol/chloroform method, P<0.05.ConclusionsIn patients with suspected pulmonary tuberculosis in sputum specimens for testing, can choose imported centrifugal column priority method as effective TBDNA extraction method.

Tuberculosis; Diagnosis; TB-DNA

R521

B

1671-8194（2014）36-0016-02