硝酸鎵可降解涂層的體外抗菌實驗

朱元元，楊雙旺，邱 彥

細菌可在各種生物和非生物的表面形成生物膜，生物膜包含蛋白質、多糖和核酸等基質。生物膜形成是一個復雜的發展過程［1-4］，生物膜在器械相關的感染發病機制中扮演重要角色。細菌生物膜的形成是院內感染的重要來源，可導致導尿管、血管內導管相關的菌血癥和呼吸機相關性肺炎［5-6］。生物膜的形成使細菌避開免疫系統的攻擊，因為在生物膜中的細菌有基質的保護，且細胞的代謝速度較慢，使它們能夠在高于最小抑菌濃度100～1000倍的抗生素中生存下去［7-9］。而大量使用抗生素則增加了抗生素耐藥性［10-11］，因此對新的抗菌藥物的需求日益迫切。

在幾乎所有的病原體中，鐵離子(Fe3+)在DNA合成，呼吸鏈和關鍵酶的功能和氧化應激防御反應中均有重要作用，是細菌生長所必需的［12］。金屬鎵的離子半徑幾乎和鐵一樣，而且許多生物都無法區分鎵離子(Ga3+)和Fe3+，因此Ga3+可用以破壞依賴Fe3+的生化反應。體外和體內研究表明Ga3+通過干擾Fe3+的功能，可抑制各種病原體生長［13］。

本課題組的前期研究中已制備了一種可以黏附在塑料表面的硝酸鎵聚合物［14］。本研究對此材料以硝酸鎵聚合物包被并對其抗菌活性進行對比分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源和培養［15］銅綠假單胞菌(ATCC27853)購自國家衛生部臨床檢驗中心。銅綠假單胞菌在LB液體培養基(培養基由10.0 g/L的蛋白胨，5.0 g/L的酵母提取物，10.0 g/L的氯化鈉組成，pH 7.0～7.2)，37℃下振蕩培養24 h。收集菌種并用生理鹽水稀釋。

1.2 最小抑菌濃度的測定［14］37℃過夜培養的試驗菌株用新鮮的胰蛋白酶大豆肉湯稀釋10倍。由于吸光度和細菌密度成正比，因此采用酶標儀測其在600 nm處的吸光度(OD值)作為相對定量，并以此代表細菌的生長程度。37℃下培養試驗菌株以酶標儀測其600 nm的OD值達到1.5左右，即為達到實驗所需的指數生長階段。將其加入到含不同濃度硝酸鎵的孔中，無菌對照孔不加細菌，陽性對照孔不加硝酸鎵。

1.3 表面涂層 0.5%的明膠水溶液高壓滅菌。冷卻后，將明膠溶液、硝酸鎵(Sigma公司產品)和乙二胺四乙酸(EDTA)溶液混合，硝酸鎵終濃度為20 μM，EDTA的終濃度為10 μM。將聚氯乙烯(polyvinyl chloride polymer，PVC)片用打孔機制備成直徑6 mm的圓片，用無水乙醇、去離子水超聲波振蕩清洗15 min，放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經15磅15～20 min高壓消毒后，放在37℃溫箱2 d，使完全干燥。將薄片浸入到上述明膠-硝酸鎵-EDTA混合液，取出置于超凈臺中自然干燥，備用。

1.4 抗生物膜持久性檢測［14］將10 mL消毒的尿液置于50 mL聚苯乙烯管(Falcon公司產品)。加入薄片，37℃靜置。分別在1、2、4、7 d后取出薄片，無菌過濾紙吸干，進行Kirby-Bauer法(K-B法)擴散試驗。在超凈臺中，嚴格按無菌程序用接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養基上，再取薄片貼到LB固體培養基(每升含蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化鈉10 g和瓊脂15 g)表面，在平皿中央貼1片，外周等距離貼5片，使薄片與培養基緊密相貼。將平皿培養基置于37℃溫箱中培養24 h后，測量抑菌圈的直徑。

采用稀釋法測定膜上依附的細菌數量。分別取不做處理的PVC片和經過涂層處理的PVC片各6片，置于含20 mL銅綠假單胞菌LB培養液，37℃恒溫培養7 d。取經培養的PVC片置于5 mL生理鹽水震蕩30 min，倒出生理鹽水，再加1 mL生理鹽水震蕩15 min后取出薄片，合并生理鹽水以10倍梯度連續稀釋至10 000倍，各梯度樣本分別以0.1 mL量加入無菌LB固體培養基培養皿中涂布培養，置37℃培養18 h，觀察菌落生長情況，作菌落計數。按以下公式計算出細菌數:細菌數=菌落數×稀釋倍數×10。

1.5 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件進行數理統計，實驗所得計量數據以均數±標準差(±s)表示，組間均數間的兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 最小抑菌濃度(MIC)的測定 在96孔板中將細菌接種于含硝酸鎵5～30 μM的培養液中。37℃培養24 h后測定600 nm的OD值。結果顯示，硝酸鎵劑量依賴性地抑制細菌生長，MIC約為20 μM。

圖1 硝酸鎵對銅綠假單胞菌的抑制作用

2.2 對生物膜的抑制作用 將PVC片在尿液中浸泡1～7 d后，測定PVC片的抑菌作用。7 d后K-B擴散試驗顯示，抑菌圈均保持在20.0mm以上［第0、1、2、4、7 天抑菌圈直徑分別為(22.1 ±1.3)mm、(22.3 ±1.2)mm、(21.8 ±0.9)mm、(21.1 ±0.7)mm、(20.1 ±1.7)mm］，組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)，抑菌效果較為穩定。

為了進一步評價硝酸鎵涂膜抑制細菌生物膜形成的能力，分別將經硝酸鎵處理過的和未處理過的PVC片放到銅綠假單胞菌的細胞懸液中，并在37℃條件下培養24 h，無需振蕩，再采用稀釋法分別測定膜上依附的細菌數量。結果顯示，未處理的PVC片上每片的平均細菌數為(2.29±0.13)×107個，而處理過的為(3.33±0.92)×103個，差異有統計學意義(P ＜0.01)。

3 討論

越來越多的臨床治療需要使用植入式器械。這些器械，不論是作為短期使用還是植入體內終身使用，均可因為細菌生物膜的形成導致嚴重的全身感染。這在整形外科中極為常見，細菌生物膜的形成會導致嚴重的并發癥，包括義肢感染等，致死亡率和醫療費用的增加［16-17］。本文研究了常用作醫療植入材料的PVC上的硝酸鎵涂層對生物膜形成的影響。

生物膜的形成是個復雜的發展過程，包括細菌黏附和表面固定形成菌落，并融合生物膜［1-4］。生物膜的消除亦非常困難，固定在生物膜中的細菌比游離狀態的細菌更耐抗生素。已經證明用Ga3+取代Fe3+可以干擾細菌DNA和蛋白質的合成，抑制細菌生物膜的形成。Ga3+已被FDA批準治療惡性高鈣血癥，具有很好的安全性，本文硝酸鎵終濃度為20 μM。明膠是以動物的皮、骨為原料制成的蛋白分子聚合物質。明膠分子結構上有大量的羥基、羧基和氨基，使得明膠具有極強的親水性，又因其具有無毒、生物相容性好并在生物體中可完全降解等優點，故選用明膠作為溶解基質。結果表明，涂布EDTA-鎵-明膠的PVC具有較好的抗菌作用。將EDTA-鎵-明膠涂覆在PVC表面，在防止醫療器械感染上的用途值得進一步研究。

［1］O’Toole G，Kaplan HB，Kolter R.Biofilm formation as microbial development［J］.Annu Rev Microbiol，2000，54(1):49-79.

［2］Costerton JW，Stewart PS，Greenberg EP，et al.Bacterial biofilms:a common cause of persistent infections［J］.Science，1999，284(5418):1318-1322.

［3］Hall-Stoodley L，Stoodley P.Evolving concepts in biofilm infections［J］.Cell Microbiol，2009，11(7):1034-1043.

［4］Stewart PS，Costerton JW.Antibiotic resistance of bacteria in biofilms［J］.Lancet，2001，358(9276):135-138.

［5］Adair CG，Gorman SP，Feron BM，et al.Implications of endotracheal tube biofilm for ventilator-associated pneumonia［J］.Intensive Care Med，1999，25(10):1072-1076.

［6］Koerner RJ.Contribution of endotracheal tubes to the pathogenesis of ventilator-associated pneumonia［J］.J Hosp Infect，1997，35(1):83-89.

［7］Campoccia D，Montanaro L，Arciola CR，et al.The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance［J］.Biomaterials，2006，27(10):2331-2339.

［8］Raad II，Hanna HA.Intravascular catheter-related infections:new horizons and recent advances［J］.Arch Intern Med，2002，162(5):871-878.

［9］Donlan RM.Biofilms and device-associated infections［J］.Emerg Infect Dis，2001，7(2):277-281.

［10］Mah TF，O’Toole GA.Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents［J］.Trends Microbiol，2001，9(1):34-39.

［11］曾宏逵，譚偉龍，錢萬紅，等.過氧乙酸復方消毒劑殺滅枯草桿菌芽孢的實驗研究［J］.東南國防醫藥，2010，12(2):97-99.

［12］Bullen JJ，Rogers HJ，Spalding PB，et al.Iron and infection:the heart of the matter［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2005，43(2):325-330.

［13］Kaneko Y，Thoendel M，Olakanmi O，et al.The transition metal gallium disrupts Pseudomonas aeruginosa iron metabolism and has antimicrobial and antibiofilm activity［J］.J Clin Invest，2007，117(4):877-888.

［14］Zhu Y，Jin F，Yang S，et al.Pre-treatment with EDTA-gallium prevents the formation of biofilms on surfaces［J］.Exp Ther Med，2013，5(4):1001-1004.

［15］朱元元.硝酸鎵和萬古霉素抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的協同作用［J］.東南國防醫藥，2009，11(6):499-501.

［16］Busscher HJ，Rinastiti M，Siswomihardjo W，et al.Biofilm formation on dental restorative and implant materials［J］.J Dent Res，2010，89(3):657-665.

［17］Arciola CR，Campoccia D，Speziale P，et al.Biofilm formation in staphylococcus implant infections.A review of molecular mechanisms and implications for biofilm-resistant materials［J］.Biomaterials，2012，33(10):5967-5982.