細胞因子誘導的殺傷細胞基本特性及抗腫瘤效應研究

程民，陳穩，毛菊，王靜，程翠，沈國棟，卞庚，徐婷娟，徐維平，沈干，胡世蓮

（1.安徽醫科大學附屬安徽省立醫院、安徽省立醫院，合肥 230001；2.安徽省老年醫學研究所；3.腫瘤免疫與營養治療安徽省重點實驗室）

細胞因子誘導的殺傷細胞基本特性及抗腫瘤效應研究

程民1，2，3，陳穩1，2，3，毛菊1，2，3，王靜1，程翠1，沈國棟1，2，3，卞庚1，2，3，徐婷娟1，2，3，徐維平1，2，3，沈干1，胡世蓮1，2，3

（1.安徽醫科大學附屬安徽省立醫院、安徽省立醫院，合肥 230001；2.安徽省老年醫學研究所；3.腫瘤免疫與營養治療安徽省重點實驗室）

目的建立培養細胞因子誘導的殺傷（CIK）細胞方法，并評價其基本特點、體內外抗腫瘤活性及安全性。方法使用抗CD3單克隆抗體、rhIL-2及rh IFN-γ刺激PBMC細胞，使其在體外大量擴增，利用流式細胞術、體外殺傷實驗及荷人卵巢癌小鼠模型檢測CIK細胞的特點及抗腫瘤活性；并檢測CIK細胞中外源性因子污染情況及其急性毒性作用。結果體外培養21 d后，CIK細胞總數可達1010以上，其主要成分為CD3＋CD8＋T細胞及CD3＋CD56＋NKT細胞，CIK細胞在體外對Ho8910、A549、K562及HepG2細胞均有較高的殺傷活性，并對荷瘤小鼠具有治療作用。同時在CIK細胞中未檢測到外源性病原體污染。結論CIK細胞在體內外均具有較高的抗腫瘤活性且無毒性作用。

免疫療法；細胞培養技術；細胞因子誘導殺傷細胞；卵巢腫瘤；疾病模型，動物

目前，手術和放、化療已成為臨床上治療腫瘤的主要手段，并取得了一定的治療效果，但目前腫瘤的復發率和死亡率仍然較高。腫瘤細胞免疫治療因其殺瘤識別譜廣、抗癌殺傷力高、毒副作用小等特點，已成為第四大腫瘤治療模式。細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK細胞）是由細胞因子（如IL-2、IL-1α、IFN-γ和抗CD3McAb等）在體外誘導人外周血或臍血單個核細胞而獲得的一群異質細胞，具有抗腫瘤作用，目前已應用于腫瘤患者的臨床治療，但不同的培養方法對CIK細胞抗腫瘤活性影響很大，直接關系到腫瘤患者的治療效果［1］。因此，建立規范化的培養方法，獲得高抗腫瘤活性的CIK細胞，并將其應用于臨床腫瘤治療具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 外周血單個核細胞分離、培養試劑 本研究中，共收集健康志愿者外周血標本10份，50mL／份。

1.1.2 細胞株、培養基 K562細胞、A549細胞、HepG2細胞及vero細胞購自美國典型培養物保藏中心（ATCC），Ho8910細胞購自中科院上海細胞庫。RPMI 1640、DMEM干粉培養基購自Gibco公司，碳酸氫鈉（分析純）、二甲基亞砜（分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司，胎牛血清購自上海依科賽生物制品有限公司，胰蛋白酶購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

圖2 培養不同天數后CIK細胞表面CD3、CD4、CD8及CD56分子的表達(n=10)

圖4 體外培養的CIK細胞對荷瘤小鼠的治療作用(*P＜0.05)

插圖3-1

1.1.3 流式細胞術分析試劑 FITC-anti-CD8、PE-anti-CD56、PE-Cy5-anti-CD3及Alexa-647-anti-CD4等單克隆抗體及各種抗體相對應的同種型抗體均購自BD Pharmingen公司（San Diego，USA）。Mouse IgG（11.5 mg／mL）購自BIODESIGN公司（Saco，USA）。KH2PO4、Na2HPO4·12H2O及NaCl等分析純試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4 細胞毒活性檢測試劑 Na51CrO4溶液購自中國同位素總公司（美國PerkinElmer公司生產），TritonX-100購自Sigma Chemical Co.公司。

1.1.5 實驗動物 C57BL／6小鼠，SPF級，雌性，6～8周齡，購于中國科學院上海斯萊科實驗動物中心。裸鼠（BALB／c背景），SPF級，雌性，4～5周齡，購于南京大學模式動物研究所。實驗動物飼養條件為：SPF級，22°C，55%濕度，12 h白天／黑夜節奏。實驗流程和小鼠處理過程遵循實驗動物管理規范條例。

1.1.6 外源性因子檢測試劑 改良馬丁培養基、硫乙醇酸鹽流體培養基、肺炎支原體肉湯培養基、支原體瓊脂培養基、支原體半流體培養基、精氨酸支原體肉湯培養基購自中國食品藥品檢定研究院，支原體染色檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所，乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）、單純皰疹病毒Ⅱ型核酸擴增（PCR）熒光定量檢測試劑盒、人類免疫缺陷病毒1型核酸定量檢測試劑盒（巢式PCR-熒光法）、人巨細胞病毒核酸擴增熒光定量檢測試劑盒及丙型肝炎病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）購自達安基因股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 外周血單個核細胞分離、CIK細胞培養 使用無菌淋巴細胞分離液分離外周血PBMC細胞，并使用30 mL CIK細胞培養液（GT-T551培養基＋1000IU／mL IL-2＋1000IU／mL IFN-γ）重懸分離所得的PBMC細胞，置于已包被抗CD3單克隆抗體的75 cm2培養瓶中，置于飽和濕度、37℃、5.0%CO2培養箱培養，期間根據細胞生長情況添加CIK細胞培養液。

1.2.2 流式細胞術分析 每個樣品管取PBMC細胞或培養不同時間的CIK細胞1×106個，使用100μL 1×PBS溶液重懸細胞成單細胞懸液；每管加入mouse IgG溶液（0.1μg／μL）2μL，室溫，封閉15～30 min；向相應樣品管中加入適量待測分子的熒光標記抗體或同種型抗體，4°C，避光，標記30 min；每管加入1.0 mL 1×PBS溶液，混勻細胞，4℃，3000 r／min，5min，離心，棄上清；重復洗滌2次；使用200μL 1×PBS溶液重懸標記后的細胞，FACSCalibur儀器檢測，WinMDI2.8軟件分析所得數據。

1.2.3 CIK細胞體內抗腫瘤效應檢測 使用Ho8910細胞通過腹腔注射的方式建立裸鼠卵巢癌腹水模型［2］，將制備好的CIK細胞溶液（4.0×108／mL）以腹腔注射的方式接種至成瘤鼠（接種Ho8910細胞35 d后，32 d成瘤）腹腔內，體積為250μL；同時設立對照組，給予腹腔注射PBS溶液250μL；每周3次，連續2周；觀察小鼠腹圍、體質量、存活率、生存時間等。

1.2.4 外源性因子檢測 參照《中國藥典》三部（2010年版）方法，檢測培養21 d后CIK細胞中細菌、真菌、支原體等外源性因子的污染情況，并利用PCR方法檢測病毒因子等。

1.2.5 急性毒性實驗 按照《中國藥典》三部（2010年版）方法，檢測CIK細胞對C57BL／6小鼠的急性毒性作用。

1.3 統計學處理 數據使用SPSS10.0軟件分析，用t檢驗或方差分析比較獨立樣本之間的差異，當P＜0.05時，認為差異具有顯著性，生存分析使用Kaplan-Meier方法，散點圖使用ORIGIN 7.5軟件繪出并分析。

2 結果

2.1 CIK細胞體外擴增方法的建立 利用顯微鏡觀察CIK細胞生長狀態，CIK細胞呈懸浮生長狀態，成團細胞較多，生長狀態較好，細胞邊緣清晰，折光性好；每周細胞計數2次，按照培養體積計算細胞總數，并以細胞總數對培養時間作圖，結果如圖1所示，培養7 d后CIK細胞出現快速增殖，培養至21 d左右增殖速度減慢，處于平臺期，培養21 d后細胞總數超過1×1010個。

2.2 體外培養過程中CIK細胞的表面分子的表達情況 體外培養0、7、14 d及21 d后CIK細胞表面CD3、CD4、CD8與CD56分子的表達情況，如圖2所示。新分離的外周血淋巴細胞中CD3＋CD4＋的T細胞約占40%，其次為CD3＋CD8＋T細胞約為20%，CD3-CD56＋NK細胞約12%，CD3＋CD56＋NK細胞比例約4%；培養7 d后CD3＋CD8＋T細胞所占比例為76.8%，明顯增加（P＜0.05）；CD3＋CD56＋NK細胞比例為4.8%，亦有所增加（P＜0.05），而CD3＋CD4＋T細胞及CD3-CD56＋NK細胞比例為11.7%和4.7%，明顯降低（P＜0.05）；培養14～21 d后，CD3＋CD8＋T細胞及CD3＋CD56＋NKT細胞所占比例進一步增加，分別為89.58%及25.54%。

2.3 CIK細胞對腫瘤細胞的體外殺傷活性 體外培養21 d后，CIK細胞對Ho8910細胞、K562細胞、HepG2細胞及A549細胞均有不同程度的殺傷作用，對K562細胞和Ho8910細胞的殺傷力最強，在效／靶比為50∶1時，殺傷效率在65%～85%之間；CIK細胞對HepG2細胞和A549細胞也具有較強的殺傷活性，在效／靶比為50∶1時，殺傷效率在40%～60%之間（圖3）。

2.4 CIK細胞的體內抗腫瘤效應 經CIK細胞治療兩周后，實驗組小鼠腹圍變化較對照組慢，小鼠生存狀態較對照組好，平均生存時間對照組為59.75 d，實驗組為80.75 d，實驗組與對照組相比較，差異有統計學意義（P＜0.05，圖4）。

2.5 CIK細胞外源性因子檢測

2.5.1 細菌、真菌檢測 取CIK細胞培養上清液樣品，培養14 d后，在改良馬丁培養基（25℃）和硫乙醇酸鹽流體培養基（25℃、33.5℃）中均無真菌或細菌生長。

2.5.2 支原體檢查 CIK細胞培養上清液在支原體瓊脂培養基、肺炎支原體肉湯培養基、精氨酸支原體肉湯培養基、支原體半流體培養基中培養21 d后，各接種管中均無支原體或其他生物生長。在CIK細胞培養上清接種的vero細胞中亦未檢測到支原體。

2.5.3 病毒因子檢測 利用PCR方法檢測CIK細胞及其培養上清中病毒核酸的表達情況，結果均為陰性。

2.6 急性毒性檢測 接種CIK細胞7 d后，實驗組和對照組小鼠均為未發生毒性反應、過敏反應、局部刺激反應；實驗組及對照組小鼠體質量增加平穩，小鼠體質量及體質量增加量兩組之間均差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

CIK細胞是由細胞因子在體外誘導人外周血或臍血單個核細胞而獲得的一群異質細胞，主要效應細胞是CTL細胞及NK細胞，目前已應用于腫瘤患者的臨床治療［3］，但不同的培養方法對CIK細胞抗腫瘤活性及安全性影響很大，直接關系到腫瘤患者的治療效果［1］。因此，建立規范化的體外擴增方法，獲得高抗腫瘤活性的CIK細胞，并將其應用于臨床腫瘤治療具有重要意義。

在本研究中，我們建立和完善了體外擴增CIK細胞的方法，培養21 d后CIK細胞的總數可達1010以上，可以滿足腫瘤患者臨床輸注的需要。新分離的外周血淋巴細胞中CD3＋CD4＋的T細胞所占比例較高，達40%，其次為CD3＋CD8＋T細胞，為20%；CD3-CD56＋NK細胞占12%，CD3＋CD56＋NK細胞比例最低，約為4%；培養7 d后，CD3＋CD8＋T細胞所占比例明顯增加（P＜0.05），CD3＋CD56＋NK細胞比例亦有增加（P＜0.05），而CD3＋CD4＋T細胞及CD3-CD56＋NK細胞明顯降低（P＜0.05）；培養14～21 d后，CIK細胞中主要效應細胞CD3＋CD8＋的CTL細胞及CD3＋CD56＋NK細胞所占比例分別為89.58%及25.54%。利用51Cr釋放實驗，檢測培養21 d后的CIK細胞對Ho8910細胞、K562細胞、HepG2細胞及A549細胞的殺傷活性；結果表明，CIK細胞對上述腫瘤細胞均有不同程度的殺傷活性，特別是對Ho8910細胞的殺傷活性最強，在效／靶比為50∶1時，殺傷效率約為85%；為進一步進行患者體內抗腫瘤治療奠定了基礎。

卵巢癌的死亡率在婦科惡性腫瘤中占第一位［4］。細胞免疫治療方法作為傳統治療方法（手術和放化療）的補充，將有助于卵巢癌患者病情控制和生存質量的提高。目前已有多種細胞治療的方法用于卵巢癌過繼轉輸治療，但由于體外擴增細胞技術上不足，限制了臨床上的應用［5-7］。本研究利用規模化培養的CIK細胞對人卵巢癌（Ho8910細胞）裸鼠腹水瘤模型進行治療，評價CIK細胞對卵巢癌的治療作用；在小鼠成瘤后并有明顯的腹水形成時（接種后35 d），給予CIK細胞進行免疫治療，效果較為明顯，表現為小鼠體內腫瘤進展速度減慢，生存質量提高；最終對照組和實驗組小鼠均死亡，死亡率未降低，但平均存活時間延長（圖4）。本研究對小鼠進行多次腹腔注射CIK細胞，對卵巢癌進行細胞治療，效果較為理想，并且未出現不良反應。在腹腔內，CIK細胞對卵巢癌細胞具有直接的細胞毒活性，相對于靜脈注射，腹腔注射更方便，更安全。同時，本研究中所擴增的CIK細胞進行了外源性因子檢測及急性毒性實驗，培養21 d的CIK細胞無細菌、真菌、支原體及病毒因子等的污染，對受試小鼠亦無急性毒性作用。

綜上所述，本研究建立了一種規范化的CIK細胞體外擴增方法，培養21 d后，CIK細胞的主要成分為CTL細胞和NKT細胞，且數量、質量均可達到臨床治療的需要；CIK細胞對多種腫瘤細胞具有較強的殺傷活性，并具有較好的體內抗癌作用，不存在外源性因子的污染及急性毒性反應等，具有較好的臨床應用前景。

（本文圖1～4見插圖3-1）

［1］ Durrieu L，Lemieux W，Dieng MM，et al.Implication of different effector mechanisms by cord blood-derived and peripheral blood-derived cytokine-induced killer cells to kill precursor B acute lymphoblastic leukemia cell lines［J］.Cytotherapy，2014，（13）：842-846.

［2］ Cheng M，Ma J，Chen Y，et al.Establishment，characterization，and successful adaptive therapy against human tumors of NKG cell，a new human NK cell line［J］.Cell transplantation，2011，20（11／12）：1731-1746.

［3］ Liu J，LiH，Cao S，et al.Maintenance therapy with autologous cytokine-induced killer cells in patients with advanced epithelial ovaria cancer after first-line treatment［J］.J Immunother，2014，37（2）：115-122.

［4］ Isayeva T，Ren C，Ponnazhagan S.Recombinant adeno-associated virus 2-mediated antiangiogenic prevention in a mousemodel of intraperitoneal ovarian cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11（3）：1342-1347.

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The study on the basic characteristics and the anti-tumor effects of CIK cells

CHENGMin*，CHENWen，MAO Ju，WANG Jing，CHENG Cui，SHEN Guodong，BIAN Geng，XU Tingjuan，XU Weiping，SHEN Gan，HU Shilian
（*Anhui Province Hospital Affiliated Anhui Medical University，Hefei230001，China）

HU Shilian，Email：hushilian＠126.com

ObjectiveTo establish the methods of cytokine-induced killer（CIK）cells and evaluate the characteristics，anti-tumor activity in vitro and in vivo and the safety.MethodsAnti-CD3 mAb，recombinant human interleukin2（rhIL-2）and recombinanthuman interferon-γ（rhIFN-γ）were used to induce the peripheralbloodmononuclear cells（PBMCs）proliferation abundantly in vitro.Flow cytometry assay（FACS），in vitro cytotoxicity assay and tumormousemodel xenografted with Ho-8910（human ovarian cancer cell line）were used to detect the characteristics and the anti-tumor activityof CIK cells.Additionally，the contamination of exogenous agents and the acute toxicity effectof CIK cellswere also determined.ResultsAfter21 days in vitro culture，the total number of CIK cells weremore than 1010，among which there weremainly CD3＋CD8＋T cells and CD3＋CD56＋NKT cells.CIK cells displayed high cytotoxicity against Ho8910，A549，K562 and HepG2 cells in vitro，and they also showed therapeutic effects in tumor xenograftedmice.Additionally，no acute toxicity was observed in CIK cells-treatedmice，and therewas also no contamination of bacteria，fungus，mycoplasma and virus in CIK cells.ConclusionCIK cells have high antitumor activity without any toxic side effects.

Immunotherapy；Cell culture techniques；Cytokine-induced killer cells；Ovarian neoplasms；Disease Models，Animal

R730.51

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.03.019

2014-02-20）

國家自然科學基金面上項目（81071808）；安徽省自然科學基金項目（1408085MH156）；安徽省醫學研究項目（13zc025）；安徽省科技攻關項目（12010402126）；安徽省腫瘤免疫營養診療產業創新團隊資助

程民，助理研究員，Email：chengmin＠ustc.edu.cn

胡世蓮，主任醫師，教授，博士生導師，Email：hushilian＠126.com