喜炎平注射液溶血的分光光度法檢查

邱海強

（江蘇省無錫藥品檢驗所，江蘇 無錫 214028）

喜炎平注射液溶血的分光光度法檢查

邱海強

（江蘇省無錫藥品檢驗所，江蘇 無錫 214028）

目的建立喜炎平注射液溶血檢查的分光光度方法。方法按《中國藥典》2010年版一部方法配制供試品溶液、陰性對照和陽性對照溶液，用分光光度法測定吸光度，并計算溶血率，檢測波長545 nm。結果溶血率上限定為5%，樣品的溶血率均＜1%。結論喜炎平注射液可以用分光光度法進行溶血檢查，其靈敏度高于藥典方法。

喜炎平注射液；溶血；分光光度法

喜炎平注射液，主要成分為穿心蓮內酯總磺化物，具有清熱解毒、止咳止痢的作用，臨床用于支氣管炎、扁桃體炎、細菌性痢疾等。其現行質量標準為國家藥品標準WS-10863（ZD-0863）-2002-2011Z，規定“溶血與凝聚”項按《中國藥典》2010年版一部附錄ⅩⅢ H溶血與凝聚檢查法進行[1]。藥典附錄溶血與凝聚檢查法是經典的傳統方法，檢驗結果采用目測觀察。主要缺點：檢驗結果靠檢驗者的經驗來判斷，主觀干擾較大；由于采用目測觀察，當對檢驗結果有異議時，難以提供客觀的數據來佐證檢驗結果?，F采用分光光度法測定供試品溶液的吸光度并計算溶血率，對喜炎平注射液的溶血檢查方法進行了改進。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：Cary100紫外-可見分光光度計，SPX-250B-Z型生化培養箱，均經檢定合格。80-2型離心沉淀器。

1.2 動物：普通級新西蘭家兔，體質量3.5 kg，雄性，實驗動物使用許可證號SYXK（蘇）2014-0012號。

1.3 試藥：喜炎平注射液，規格2 mL∶50 mg，批號20110526、20120423、20121217、2013012402、2013030802、2013033003，江西某藥業有限公司（依次編為樣1～樣6）。氯化鈉注射液，規格500 mL∶4.5 g，批號131012ZT，安徽某藥業有限責任公司。純化水。

2 方法與結果

2.1 2%紅細胞混懸液的制備：取兔心血，按《中國藥典》2010年版一部附錄ⅩⅢ H規定的方法，制成2%紅細胞混懸液[2]+92。

2.2 藥典標準檢驗：取潔凈玻璃試管，按表1所示依次加樣，混勻后立即置37 ℃溫育，3 h后觀察溶血和凝聚反應。如溶液呈澄明紅色，管底無細胞殘留或有少量細胞殘留，表明有溶血發生；若有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，輕輕倒轉3次仍不分散，表明可能有紅細胞凝聚發生，顯微鏡下觀察有紅細胞凝集，則為凝聚。溶血或凝聚均以“+”表示。如紅細胞全部下沉，上清液無色澄明，表明無溶血發生；無棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，表明無紅細胞凝聚發生。均以“-”表示。結果6批供試品按藥典標準檢驗，溶血與凝聚檢查均符合規定。見表2。

2.3 分光光度法檢查：參照GB/T 14233.2-2005中“溶血試驗”方法，并以該標準規定的溶血率5%作為合格上限。按表1所示加樣，6批喜炎平注射液供試品管、陰性對照管、陽性對照管平行各3管，6批供試品對照管各1管?；靹蚝罅⒓粗?7 ℃溫育3 h。1500轉/分離心15 min，取上清液。

2.3.1 取6批供試品對照溶液，以氯化鈉注射液為空白，按紫外-可見分光光度法，在波長200～800 nm范圍內進行掃描。6批結果一致，選2號樣品見圖1。

2.3.2 供試品對照溶液吸光度的測定：以氯化鈉注射液為空白，用分光光度法在545 nm處測定供試品對照溶液吸光度，結果見表3。

圖1表明，喜炎平注射液的最大吸收波長在300 nm以下，在400～800 nm范圍內，吸光度很小。而溶血反應產生的血紅蛋白，其最大吸收波長為545 nm[3]，因此，樣品本身對血紅蛋白的檢測干擾很小。同時，檢測供試品溶液時，是以供試品對照溶液作空白，其影響可完全消除。表3結果進一步證實了這一結論。

2.3.3 供試品溶液吸光度檢測及溶血率計算：以氯化鈉注射液作空白，檢測波長545 nm，測定陰性對照（3管）和陽性對照（3管）溶液的吸光度。分別以6批供試品對照溶液為空白，測定6批供試品溶液（各3管）的吸光度。以3管吸光度的平均值計算溶血率[3]，結果6批供試品的溶血率均＜1%。參照GB/T 14233.2-2005溶血試驗的判斷標準，溶血率＜5%，則判定樣品溶血檢查符合規定[3]。分光光度法與藥典方法結果一致。見表4。

溶血率（%）計算公式：%=（A-B）/（C-B）×100%。式中A、B、C分別為供試品溶液、陰性對照、陽性對照的吸光度。

2.3.4 “不合格樣品”的制備及檢測：取2、4、6號喜炎平注射液，按表5加樣，混勻后立即置37 ℃溫育3 h，取出觀察溶血結果。3批供試品均在9號管開始出現明顯溶血現象，8號管隱約可見輕微溶血，而1～7號管均無明顯溶血現象。再1500轉/分離心15 min，取上清液。離心后8號管上清液可見較明顯的溶血現象。按2.3.3方法測定吸光度并計算溶血率，陰性、陽性對照采用表4數據。結果見表6、表7。

表1 喜炎平注射液溶血與凝聚藥典檢查方法

表2 喜炎平注射液溶血與凝聚藥典檢查結果

表3 供試品對照溶液545 nm波長吸光度

表4 供試品溶液吸光度及溶血率結果

表5 “不合格樣品”的制備

表6 “不合格樣品”吸光度結果

表7 “不合格樣品”溶血率結果

圖1 喜炎平注射液掃描結果

表7結果表明，目測法與分光光度法相比，當溶血率約為5%～7%時僅能觀察到輕微溶血現象，而觀察到明顯溶血現象時的溶血率已達到17%。上述實驗結果證明，采用分光光度法，比藥典方法能更靈敏地檢查出溶血現象。

3 討 論

3.1 喜炎平注射液的主要原料穿心蓮內酯總磺化物由中藥材提取而成，成分較為復雜，容易引起過敏反應、溶血、紅細胞凝聚等不良反應，因此除注射劑通用的熱原、無菌檢查外，現行的法定標準規定了溶血與凝聚、異常毒性、過敏反應的檢查。

3.2 按法定標準檢驗時，由于紅細胞的沉降不可能完全，因此輕微溶血所產生的血紅蛋白，其顏色被紅細胞掩蓋，造成判斷困難。同時藥典標準中對溶血的描述為“試管中的溶液呈澄明紅色”，其紅色的程度無法定量，檢驗者的判斷各有不同，容易造成誤判。采用分光光度法則可避免這一缺點。

3.3 藥典規定對紅細胞凝聚采用顯微鏡下觀察。隨著顯微攝像技術的逐步推廣，建議將紅細胞凝聚的檢查結果拍照留存，以保存檢驗的原始證據。

[1] 國家食品藥品監督管理局.WS-10863(ZD-0863)-2002-2011Z.國家藥品標準[S].

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[S].北京:化學工業出版社,2010:附錄30.

[3] 國家質量監督檢驗檢疫總局.GB/T 14233.2-2005.中華人民共和國國家標準[S].

The Spectrophotometric Method for the Hemolysis Examination of Xiyanping Injection

QIU Hai-qiang
(Wuxi Institute for Drug Control, Wuxi 214028, China)

ObjectiveTo establish a spectrophotometric method for the hemolysis examination of Xiyanping injection.MethodThe sample solution, negative control solution and positive control solution were prepared according to the method of Chinese Pharmacoperia (2010 edition, Vol Ⅰ), the light absorbance at the wavelength of 545 nm was detected using spectrophotometric method, and the hemolysis rate was calculated.ResultThe upper limit of the hemolysis rate was 5%, and the hemolysis rate of all of the samples was less than 1%.ConclusionThe spectrophotometric method can be used for the hemolysis examination of Xiyanping injection, the sensitivity is higher than that of the Pharmacoperia method.

Xiyanping injection; Hemolysis; Spectrophotometry

R282.710.5

B

1671-8194（2014）29-0070-02