奧硝唑片人體生物等效性研究

路文斌

(中國人民解放軍第86醫院，安徽 馬鞍山 243100)

奧硝唑片人體生物等效性研究

路文斌

(中國人民解放軍第86醫院，安徽 馬鞍山 243100)

目的比較口服奧硝唑片試驗制劑與國產上市制劑的藥代動力學參數，進行生物利用度和生物等效性評價。方法開放、隨機、單次給藥、雙周期交叉臨床研究。共20例健康受試者。結果試驗制劑和參比制劑的藥代動力學結果：T1/2分別為（17.010±2.682）h和(17.446 ±2.519)h；Tmax分別為(1.550±0.759)h和(1.250±0.526)h；Cmax分別為(9.476±1.083)μg/μL和(9.592±1.251)μg/μL；AUC0-t分別(225.604 ±44.327)μg/(μL·h)和(213.880±43.834)μg/(μL·h)；AUC0-∞分別為(231.269±48.014)μg/(μL·h)和(219.655±46.518)μg/(μL·h)。試驗制劑對于參比制劑的平均相對生物利用度F值(106.9±15.4)%。兩種制劑的AUC0-t、AUC0-∞及Cmax經對數轉換后雙單側t檢驗結果P＜0.05，接受兩種制劑生物等效的假設。90%置信區間的計算結果：Cmax為93.7%～104.5%，AUC0-t為100.0%～112.1%，AUC0-∞為99.7%～111.9%，按照生物等效性判定標準，可判定兩種制劑生物等效。結論兩制劑間無顯著性差異，兩制劑具有生物等效性。適用與Ⅰ期臨床研究。

奧硝唑；生物等效性；生物利用度；HPLC

奧硝唑是繼甲硝唑、替硝唑之后第3代硝基咪唑類衍生物，20世紀70年代上市以來，由于其良好的抗厭氧菌和抗原生質(如滴蟲等)感染作用，臨床應用日趨廣泛。奧硝唑進入易感的微生物細胞后，在無氧或少氧環境和較低的氧化還原電位下，其硝基易被電子傳遞蛋白還原成具細胞毒作用的氨基，抑制細胞DNA的合成，并使已合成的DNA降解，破壞DNA的雙螺旋結構或阻斷其轉錄復制，從而使病原體細胞死亡[1]。本研究目的是觀察口服奧硝唑片后的血藥濃度經時過程，估算相應的藥代動力學參數，并以國產上市制劑為參比制劑，進行生物利用度和生物等效性評價，為臨床申報提供數據[2]。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器

①藥品。試驗制劑：奧硝唑片，規格：0.25克/片；批號：090417201；參比制劑：奧硝唑片，規格：0.25克/片；批號：1005416032；對照品：奧硝唑對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100608-200301）。甲硝唑對照品（內標，中國藥品生物制品檢定所，批號：100191-200305）。②試劑。甲醇、乙腈（TEDIA公司），色譜純；冰醋酸（上海化學試劑有限公司），分析純；無水乙醚（上海中試化工總公司），分析純；水，自制超純水。③儀器。LC-10ATvp高效液相色譜儀，SPD-10Avp紫外檢測器，LC-10ATvp輸液泵，Cs-light色譜數據工作站軟件，均為日本島津公司生產；AT-130柱溫箱，AUTO SCIENCE公司生產；XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；XS105分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；16K高速離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；Milli-Q Academic純水機（密理博(上海)貿易有限公司）；HGC-24型氮吹儀（北京瑞邦興業科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 奧硝唑測定的HPLC測定方法

色譜柱：島津VP-ODS 150 mm×4.6 mm，流速：1.0 μL/min；流動相：乙腈∶水（含0.1%冰醋酸）＝25∶75（V∶V）；靈敏度：0.001AUFS；檢測波長：316 nm；柱溫：40 ℃，進樣量：20μL。

1.2.2 奧硝唑測定的HPLC的方法學驗證

1.2.2.1 奧硝唑血漿樣品處理方法：精密量取10 μL甲硝唑內標溶液（10.23 μg/μL）置于空白離心管中，加入100 μL血漿樣品，渦旋30 s，精密加入1 μL乙醚，渦旋3 min，14000 rpm離心10 min，取有機層，N2下吹干，200 μL流動相復溶，渦旋混勻，14000 rpm離心5 min，20 μL進樣。

1.2.2.2 方法的專屬性：精密取6份不同來源空白血漿各100 μL，按

1.2.2.1項下操作；同時混合該6份空白血漿，取100 μL，按1.2.2.1項下操作；取奧硝唑標準溶液(13.350 μg/μL)和內標溶液(10.23 μg/μL)各10 μL，N2下吹干，加入200 μL流動相，混勻后20 μL進樣；取奧硝唑標準溶液(13.350 μg/μL)和甲硝唑內標溶液(10.23 μg/μL)各10 μL，N2下吹干，加入100 μL空白血漿，按1.2.2.1項下操作；取1號受試者第一周期口服受試制劑24 h后收集的血漿樣品，按1.2.2.1項下操作。

1.2.2.3 血漿中奧硝唑標準曲線：精密量取10 μL甲硝唑內標溶液（10.23 μg/μL）于空白離心管中，再加入不同濃度的奧硝唑標準溶液各10 μL，N2下吹干，加入100 μL空白血漿配制成藥物濃度分別為0.083、0.334、0.668、2.670、5.340、10.680和21.360 μg/μL的樣品，按“血漿樣品處理方法”項下操作，進樣分析，建立奧硝唑的標準曲線。以待測物濃度（x）為橫坐標，待測物（As）與內標物（Ai）的峰面積比值（y，As/Ai）為縱坐標，用加權法（W=1/χ2）進行回歸運算，求得的直線方程即為標準曲線。

標準曲線各濃度點的實測值與標示值之間的偏差在可接受的范圍之內時，可判定標準曲線合格。可接受范圍一般規定為最低濃度點的偏差在±20%以內，其余濃度點的偏差在±15%以內。

1.2.2.4 血漿中奧硝唑定量下限：取空白離心管，加入甲硝唑內標溶液（10.23 μg/μL）和0.834 μg/μL奧硝唑標準溶液各10 μL，N2下吹干，再加入100 μL空白血漿配制成血漿中藥物濃度為0.083 μg/μL的樣品，共5份，按1.2.2.1項下操作。每個濃度取5個樣本進行分析，根據伴隨的標準曲線，計算定量下限（LLOQ）樣品的濃度。其準確度應在真實濃度的80%～120%范圍內，相對標準差(RSD)應＜20%。

1.2.2.5 血漿中奧硝唑精密度與準確度：取空白離心管加入甲硝唑內標溶液（10.23 μg/μL）10 μL，再精密加入不同濃度的奧硝唑QC溶液各10 μL，N2下吹干，加入100 μL空白血漿，配制成奧硝唑低、中、高三個濃度（分別為0.167、1.335和17.088 μg/μL）的樣品，按1.2.2.1項下操作。在同一分析批內和連續3個分析批間對奧硝唑的質控樣本進行處理分析，測定質控樣品的批內精密度與準確度。低、中、高濃度各6個樣本進行分析，根據伴隨的標準曲線，計算質控樣品的濃度。準確度一般應在85%～115%范圍內(一般偏差應＜15%)，在LLOQ附近應在80%～120%范圍內。

圖1A 不同來源混合空白血漿色譜圖

圖1B 奧硝唑(13.350 μg/μL)和甲硝唑(10.23 μg/μL)標準溶液加入流動相后色譜圖

圖1C 奧硝唑(1.335 μg/μL)和甲硝唑(1.023 μg/μL)血漿樣品色譜圖

圖1D 1號受試者第一周期口服受試制劑24 h后收集的血漿中奧硝唑樣品色譜圖

圖2 定量下限圖譜（LLOQ-1）

圖3 20名受試者口服奧硝唑的均數對比圖

1.2.2.6 血漿中奧硝唑提取回收率：取空白離心管，分別加入甲硝唑內標溶液（10.23 μg/μL）和不同濃度奧硝唑QC溶液各10 μL，N2下吹干，加入100 μL空白血漿配制成低、中、高三個濃度（分別為0.167、1.335和17.088 μg/μL）的樣品各3份，按1.2.2.1項下操作，每個濃度各3個樣本進行分析，得到目標分析物的峰面積為A；取空白大鼠、Beagle犬和人肝微粒體各100 μL，將空白樣品進行預處理后獲得提取液，以此提取液制備低、中、高濃度的QC樣品，每個濃度各3個樣本進行分析，得到目標分析物峰面積為B；取奧硝唑和內標各10 μL，混勻后加入流動相至100 μL，每個濃度各3個樣本進行分析，得到目標分析物平均峰面積為C；依“A/C×100%”計算提取回收率，依“B/C×100%”計算介質效應。

1.2.2.7 血漿中奧硝唑穩定性：分別考察血漿樣品處理后室溫放置穩定性，血漿樣品室溫放置再處理穩定性，血漿樣品反復凍融3次穩定性，血漿樣品長期冷凍保存條件下的穩定性。如下：取空白離心管精密加入甲硝唑內標溶液（10.23 μg/μL）和不同濃度的奧硝唑的QC溶液各10 μL，N2下吹干，加入100 μL空白血漿，配制成奧硝唑低、高兩個濃度（0.167和17.088 μg/μL）的樣品，各九份，每份三樣本分析。三份按1.2.2.1項下操作。在室溫下放置0、4 、23 h后進樣分析，考察已處理樣品在室溫條件下的穩定性；一份在室溫下放置6 h后，按1.2.2.1項下操作。進樣分析，考察藥物在血漿中的室溫放置再處理穩定性；三份在-20 ℃冰箱，反復凍融3次，每解凍一次后，按1.2.2.1項下操作。進樣分析，考察血漿樣本在反復凍融條件下的穩定性；兩份在-20 ℃冰箱分別冷凍7 、69 d后，按1.2.2.1項下操作，進樣分析，考察血漿樣本在長期冷凍條件下的穩定性。和0 h相比，不同時間段樣品RSD＜15%，可認為穩定性良好。

1.2.3 奧硝唑樣本測定過程中的隨行標準曲線及質量控制

為減少系統誤差，在進行樣品分析時，每批建立一條隨行標準曲線計算血藥濃度，并測定質控樣品（奧硝唑低、中、高濃度分別為：0.167、1.335和17.088 μg/μL），確保計算得到的藥物濃度準確可靠，操作步驟同1.2.2.3和1.2.2.5，標準曲線各濃度點的實測值與標示值之間的偏差在可接受的范圍之內時，可判定標準曲線合格。可接受范圍一般規定為最低濃度點的偏差在±20%以內，其余濃度點的偏差在±15%以內。只有合格的標準曲線才能對臨床待測樣品進行定量計算。

每個分析批生物樣品測定時應建立新的標準曲線，并隨行測定高、中、低三個濃度的質控樣品。每個濃度至少雙樣本，并應均勻分布在未知樣品測試順序中。當一個分析批中未知樣品數目較多時，應增加各濃度質控樣品數，使質控樣品數大于未知樣品總數的5%。質控樣品測定結果的偏差一般應＜15%，低濃度點偏差一般應＜20%。最多允許1/3的質控樣品結果超限，但不能出現在同一濃度質控樣品中。如質控樣品測定結果不符合上述要求，則該分析批樣品測試結果作廢。

1.2.4 奧硝唑樣本采集和測定

采用雙周期自身交叉對照設計，將入選的20名健康受試者，隨機分為A組和B組，分別口服受試制劑（奧硝唑片，0.25克/片×2片）和參比制劑（奧硝唑片，0.25克/片×2片），試驗間的清洗期為2周。

受試者于試驗當日早晨單次空腹口服相應藥物0.5 g，用200 μL溫開水送服，分別于服藥前（0 h）和服藥后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0 h從受試者靜脈前臂靜脈采血4 μL，置試管中，離心，取血漿于-20 ℃冰箱儲存，用于血藥濃度檢測。試驗間的清洗期為2周，方法同前。服藥后2 h可飲水，4 h統一進清淡飲食，該研究在符合條件的GCP試驗室完成[3]。

精密量取10 μL甲硝唑內標溶液（10.23 μg/μL）置于空白離心管中，分別加入1～20號受試者兩周期0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0 h時間點血漿樣品100 μL，按1.2.2.1項下操作。

1.2.5 統計學處理

2 結 果

2.1 奧硝唑測定的方法學結果

2.1.1 專屬性

結果見圖1（A～D），顯示奧硝唑保留時間約為5.7 min；內標甲硝唑的保留時間約為2.9 min。結果表明空白血漿中內源性物質不干擾奧硝唑和內標的測定。

2.1.2 標準曲線

從表1可以看出，所考察的三條標準曲線相關系數r均＞0.990，標準曲線范圍內線性關系良好。

表1 血漿中奧硝唑三天標準曲線峰面積比、標準曲線方程及相關系數

2.1.3 定量下限

以標準曲線的最低點作為定量下限，五樣本的分析結果可見奧硝唑定量下限偏差在15%范圍內，RSD為8.23%，符合相關技術指導原則要求。奧硝唑血樣定量下限為0.083 μg/μL。結果見表2和圖2。

表2 奧硝唑定量下限結果

2.1.4 準確度與精密度

由表3可見，與配制濃度相比，各樣品的批內的相對標準差（RSD）均＜15%。結果表明精密度與準確度均符合生物樣本檢測方法的要求。低、中、高三個濃度（0.167、1.335和17.088 μg/μL）批內和批間的相對標準差（RSD）均＜10%。

2.1.5 回收率

回收率結果見表4。奧硝唑提取回收率為67.51%～84.00%，內標甲硝唑提取回收率為58.27%～74.18%，藥物及內標回收率穩定，說明該分析方法滿足檢測要求。

2.1.6 穩定性考察

由表5(A、B)可見，和0 h相比，各個時間段RSD均＜15%。結果表明奧硝唑血漿樣本室溫下6 h內穩定性較好，血漿樣本處理后溶液23 h穩定性較好；反復凍融3次以及長期冷凍69 d穩定性均較好。

2.1.7 奧硝唑樣本測定過程中的隨行標準曲線及質量控制

伴隨標準曲線及質控測定結果顯示：伴隨標準曲線線性關系良好，質控樣品偏差在15%范圍內，RSD＜10%，血藥濃度數據測定準確，結果可靠。結果見表6、7。

表6 血漿中奧硝唑隨行標準曲線峰面積比、曲線方程及相關系數

表7 奧硝唑質控樣品測定濃度及其均數、標準差

2.1.8 奧硝唑血漿樣本測定結果

20名受試者口服受試制劑和參比制劑，血漿中奧硝唑血藥濃度-時間數據見表8、9。

2.1.9 血藥濃度-時間曲線

20名健康受試者口服受試制劑和參比制劑后奧硝唑的均數對比圖，見圖3。其中T表示受試制劑，R表示參比制劑。

2.2 統計學分析(生物等效性評價)

2.2.1 藥代動力學參數

Cmax和Tmax由實測數據直接表示。結果見表10、11。

2.2.2 方差分析

受試制劑和參比制劑兩制劑的ln(AUC0-96)、ln(AUC0-∞)、ln(Cmax)方差分析結果見表12A、表12B、表12C、表12D、表12E、表12F。結果表明ln(AUC0-96)、ln(AUC0-∞)、ln(Cmax)在藥劑間、周期間差異均無統計意義，在個體間差異有統計意義（P＜0.05）。

表12A 兩制劑ln(AUC0-96)方差分析結果

表12B 兩制劑ln(AUC0-96)個體間變異方差分析結果

表12C 兩制劑ln(AUC0-∞)方差分析結果

表12D 兩制劑ln(AUC0-∞)個體間變異方差分析結果

表12E 兩制劑ln(Cmax)方差分析結果

表12F 兩制劑ln(Cmax)個體間變異方差分析結果

2.2.3 雙向單側t檢驗及[1-2α]置信區間分析

ln(AUC0-96)、ln(AUC0-∞)、ln(Cmax)雙向單側t檢驗結果及[1-2α]置信區間分析見表13、表14、表15。表13、表14結果表明兩種制劑的藥代動力學參數ln(AUC0-96)、ln(AUC0-∞)的H0不成立，而接受H1，同時結果表明ln(AUC0-96)、ln(AUC0-∞)的[1-2α]置信區間在80%～125%范圍內，說明兩種制劑在吸收程度上具有生物等效性。表15結果表明兩種制劑的藥代動力學參數ln(Cmax)的H0不成立，而接受H1，同時結果表明ln(Cmax)的[1-2α]置信區間在75%～133%范圍內，說明兩制劑在達峰濃度上具有生物等效性。

2.2.4 Tmax的非參數檢驗

Tmax的非參數檢驗，結果表明Tmax的藥劑間差異無統計意義（P＞0.05）。見表16。

表3 奧硝唑精密度與準確度試驗結果

表4 血漿中奧硝唑和內標甲硝唑提取回收率結果

表5A 血漿中奧硝唑樣品的室溫穩定性及其處理液穩定性試驗結果

表5B 血漿中奧硝唑樣品的凍融穩定性及長期冷凍穩定性試驗結果

表8 20名受試者口服受試制劑后血漿中奧硝唑的濃度-時間數據(μg/μL)

表9 20名受試者口服參比制劑后血漿中奧硝唑的濃度-時間數據(μg/μL)

表10 20名受試者口服受試制劑后奧硝唑的藥代動力學參數(T)

表11 20名受試者口服參比制劑后奧硝唑的藥代動力學參數（R）

表13 ln(AUC0-96)等效性分析(ABE):雙向單側t檢驗(T:R)

表14 ln(AUC0-∞)等效性分析(ABE):[1-2α]置信區間法(T:R)

表15 ln(Cmax)等效性分析(ABE):雙向單側t檢驗(T:R)

表16 非參數檢驗結果

3 結論與討論

本文采用HPLC內標法測定健康受試者血漿中奧硝唑濃度，血漿中內源性物質不干擾樣品的測定，奧硝唑標準曲線線性范圍為：0.083～21.360 μg/μL，定量下限為0.083 μg/μL（SN＞10）；血漿中奧硝唑提取回收率為67.51%～84.00%，內標甲硝唑提取回收率為58.27%～74.18%；批內和批間RSD均＜10%。該方法符合生物樣品分析要求。

經藥代動力學參數計算，受試制劑的T1/2（17.010±2.682）h、Cmax（9.476±1.083）μg/μL、Tmax（1.550±0.759）h、AUC0-96（225.604±44.327）μg/(μL·h)、AUC0-∞（231.269±48.014）μg/ (μL·h)，參比制劑的T1/2（17.446±2.519）h、Cmax（9.592±1.251）μg/μL、Tmax（1.250±0.526）h、AUC0-96（213.880±43.834）μg/ (μL·h)、AUC0-∞（219.655±46.518）μg/(μL·h)。

用面積法估算試驗制劑的相對生物利用度為（106.9±15.4）%，符合生物利用度要求。

受試制劑和參比制劑中奧硝唑ln(AUC0-96)、ln(AUC0-∞)經方差分析，兩制劑間無顯著性差異；經雙向單側t檢驗，兩制劑[1-2α]置信區間分別為100.0%～112.1%、99.7%～111.9%，在80%～125%范圍內，表明兩制劑在吸收程度上具有生物等效性。ln(Cmax)經雙向單側t檢驗，兩制劑[1-2α]置信區間93.7%～104.5%，在75%～133%范圍內，表明兩制劑在達峰濃度上具有生物等效性。Tmax采用非參數檢驗，兩制劑間無顯著性差異，表明兩制劑在達峰時間上具有生物等效性。

目前已發表文獻與本試驗均采用HPLC法測定奧硝唑濃度，文獻中服藥劑量為1.5 g，采用血樣酸化后乙酸乙酯兩次提取法測定血藥濃度，而本試驗服藥劑量為0.5 g，采用乙醚一次提取法測定血藥濃度，血樣處理方法更為簡單[4]。

本試驗中受試制劑和參比制劑的各藥代參數數據與參考文獻相比并無統計學差異；數據的絕對值差異（非統計學差異）與實驗室、檢測系統、受試對象以及參比制劑批次不同等因素有關。因此，本研究中受試制劑和參比制劑的藥代動力學參數與文獻報道基本一致[5-8]。整個試驗過程中，20名受試者均表現出高度的依從性，嚴格遵循試驗方案，無漏采血樣、漏服藥現象出現，沒有出現中途脫落者。本研究可為奧硝唑臨床申報提供參考。

[1] 奧硝唑片研究者手冊[S].

[2] GCL2-1.《化學藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術指導原則》指導原則編號[H].

[3] 國家食品藥品監督管理局.藥物臨床試驗質量管理規范[S].2003.

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R969

B

1671-8194（2014）29-0062-07