HPLC法測定銀杏葉緩釋微丸膠囊中山奈素、異鼠李素、槲皮素的含量

江東波 馬曉鸝* 李朝暉 蔡偉明 官堂明

(廣東醫學院附屬醫院藥學部，廣東 湛江 524001）

HPLC法測定銀杏葉緩釋微丸膠囊中山奈素、異鼠李素、槲皮素的含量

江東波 馬曉鸝* 李朝暉 蔡偉明 官堂明

(廣東醫學院附屬醫院藥學部，廣東 湛江 524001）

目的建立以高效液相色譜法測定銀杏葉緩釋微丸膠囊中山奈素、異鼠李素、槲皮素含量的方法。方法以C18為色譜柱，流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（45∶55），檢測波長為360 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量是10 μL。結果槲皮素在0.1505～0.9030 μg（r＝0.9999）濃度范圍內有良好的線性關系，平均回收率為99.86%，RSD=0.4%；山奈素在0.1450～0.8940 μg（r＝0.9998）濃度范圍內有良好的線性關系，平均回收率為99.79%，RSD=0.5%；異鼠李素在0.0995～0.5970 μg（r＝0.9998）濃度范圍內有良好的線性關系，平均回收率為99.80%，RSD=0.3%。結論本方法簡便、準確、專屬性強，可用于該制劑的質量控制。

銀杏葉緩釋微丸膠囊；山奈素；異鼠李素；槲皮素；高效液相色譜法

銀杏葉為銀杏科植物銀杏樹的干燥葉，從銀杏葉中分離出大量的極性和非極性化合物，主要包括黃酮（雙黃酮6種，黃酮苷元7種，黃酮苷17種，桂皮酰衍生物5種）、萜類（銀杏內酯A，B，C，J及白果內酯）、烷基酚和烷基酚酸類化合物[1]。性味甘苦澀平，功效為益心斂肺、化濕止瀉、主治胸悶心痛、心悸怔忡、痰喘咳嗽、瀉痢、白帶。銀杏葉提取物在臨床上主要應用于治療冠心病、心絞痛、高血壓、高血脂癥及腦出血痙攣等癥，防治中風、心肌梗死、老年腦血管病、癡呆、大腦腦外傷后遺癥、大腦紊亂等[2]。目前開發的銀杏葉制劑有片劑、膠囊劑、注射劑、顆粒劑、口服液、滴劑、軟膏、氣霧劑、霜劑等多種劑型，也有銀杏葉緩釋片和緩釋膠囊。國內生產的銀杏葉制劑多為普通片劑和膠囊等，存在服用次數多、生物利用度低等問題，因此有必要進一步研制開發緩釋制劑，滿足預防和治療心腦血管疾病的用藥需要。本項目制備了銀杏葉緩釋微丸，為更好地控制本品質量，本文采用HPLC法同時測定其中山奈素、異鼠李素、槲皮素的含量以便考察總黃酮醇苷的含量，報道如下。

1 儀器與試藥

Waters2695-2996型高效液相色譜儀（美國Waters公司）。山奈素、異鼠李素、槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，含量測定用，批號：110861-200808、110860-200608、100081-200406）；銀杏葉緩釋微丸膠囊（自制，規格：含總黃酮醇苷2 mg/g，批號：100501、100502、100503）；甲醇、乙腈（色譜純，美國迪馬公司）；磷酸等其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適應性試驗

色譜柱：KromasilC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%的磷酸溶液=45∶55；流速：1 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在此條件下，供試品中山奈素、異鼠李素、槲皮素峰能達到基線分離，理論板數按槲皮素峰計應不低于2500，色譜圖見圖1～3。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取槲皮素、山奈素、異鼠李素對照品適量置50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，得到槲皮素、山奈素、異鼠李素混合對照品貯備液，再精密量取20 mL對照品貯備液置200 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度得到槲皮素、山奈素、異鼠李素的濃度分別是30.1、29.8、19.9 μg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取銀杏葉緩釋微丸膠囊10粒，研細，精密稱取適量（約相當于銀杏葉提取物80 mg），置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2.4 空白供試液的制備

取處方比例輔料，按銀杏葉緩釋微丸膠囊制備工藝制得空白膠囊，再按“2.3”項下制備方法制得空白供試品溶液。

2.5 輔料干擾試驗

取上述3種溶液，照“2.1”項下色譜條件，分別注入液相色譜儀，結果表明供試品色譜在與對照品色譜相應保留時間位置上，有三個相同的色譜峰，而空白供試液在此保留時間內不出峰，表明此法專屬性強。

2.6 線性關系考察

精密吸取槲皮素、山奈素、異鼠李素對照品溶液5、10、15、20、25、30 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定三者色譜峰面積，以三者的進樣量（X）為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程：槲皮素：y=-15701.9+493445.2x(r=0.9999)，線性范圍是：0.1505～0.9030 μg；山奈素：y=-8701.7+464524.1x(r=0.9998)，線性范圍是：0.1450～0.8940 μg；異鼠李素：y=-9341.3+405512.8x(r=0.9998)，線性范圍是：0.0995～0.5970 μg。

圖1 標準品高效液相色譜圖（1：異鼠李素；2：山奈素；3：槲皮素）

圖2 銀杏葉微丸膠囊樣品高效液相色譜圖

圖3 空白樣品高效液相色譜圖

表1 槲皮素回收率試驗結果

表2 山奈素回收率試驗結果

表3 異鼠李素回收率試驗結果

2.7 重復性試驗

取同一批供試品（批號100501）6份，按“2.3”項下的方法制備6份供試品溶液，并按照“2.1”項下色譜條件測定。結果槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰面積的RSD分別是＝1.1%、0.9%、1.0%，表明此法重復性好。

2.8 穩定性試驗

取上述供試品溶液20 μL，分別在0、1、2、4、8 h進樣測定，槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰面積的RSD分別是＝0.8%、0.9%、0.7%（n=5），表明供試品溶液在8 h內測定基本穩定。

2.9 進樣精密度試驗

取槲皮素、山奈素、異鼠李素對照品溶液連續進樣6次，按“2.1”項下方法測定槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰面積，結果槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰面積的RSD分別是＝0.7%、0.7%、1.0%，表明此法的進樣精密度良好。

2.10 加樣回收試驗

精密稱定銀杏葉緩釋微丸膠囊（批號：100503，含槲皮素0.75 mg/g、山奈素0.69 mg/g、異鼠李素0.32 mg/g）粉末適量（相當于銀杏葉提取物40 mg），分別置20 mL量瓶中。再精密量取槲皮素、山奈素、異鼠李素對照品溶液5 mL分別加至上述20 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件，測定槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰面積，計算其測得量，結果槲皮素、山奈素、異鼠李素的平均回收率分別是99.86%、99.79%、99.80%，RSD分別是＝0.4%、0.5%、0.3%。見表1～3。

2.11 樣品測定

取銀杏葉緩釋微丸膠囊，研細，精密稱取適量（約相當于銀杏葉提取物80 mg），置20 mL棕色容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解并定容至刻度，搖勻，濾過，按“2.1”項下色譜條件測定槲皮素、山奈素、異鼠李素峰面積，計算銀杏葉緩釋微丸膠囊中槲皮素、山奈素、異鼠李素的含量，按公式：總黃酮醇苷含量=（槲皮素的含量+山奈素的含量+異鼠李素的含量）×2.51，計算總黃酮醇苷的含量，3批樣品測定結果表明銀杏葉緩釋微丸膠囊中總黃酮醇苷的平均含量是標示量的99.5%，RSD是0.7%。

3 討 論

本文參考中國藥典2005年版的銀杏葉的質量標準[3]，并且針對本品的制備工藝及其他輔料各種因素及特性，對含量測定部分稍做改動，以保證檢驗方法的準確性。本緩釋微丸膠囊中含有的輔料較為特殊，經實驗證明，直接按藥典方法的流動相系統會使色譜峰拖尾，適當調整流動相比例可獲得較好峰型與分離度。本文建立的銀杏葉緩釋微丸膠囊的含量測定方法，經方法學驗證結果滿意。此方法簡便準確、專屬性強、精密度好、回收率高，為考察銀杏葉緩釋微丸膠囊的含量以及穩定性實驗提供可靠的方法。

[1] 何正顯,信玉瓊.銀杏葉的化學成分及抗自由基作用探討[J].山西中醫,2003,19(1):46-47.

[2] 洪梅,梁紅,潘偉明.銀杏葉黃酮類化合物生物效應研究概況[J].農業與技術,2003,2(1):33-35.

[3] 國家藥典委員會.中國藥典(Ⅰ部)[S].北京:化學工業出版社,2005: 220-221.

Determination of the Content of Haempferol, Isorhamnetin and Quercetin in Folium Ginkgo Pellets Capsules by HPLC

JIANG Dong-bo, MA Xiao-li, LI Chao-hui, CAI Wei-ming, GUAN Tang-ming
(Department of Pharmacy, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China)

ObjectiveTo establish a method for the determination of haempferol, isorhamnetin and quercetin in folium ginkgo pellets capsulesMethodsHPLC was performed on a C18column using mathanol-0.4%H3PO4(45∶55) as the mobile phase at a flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was at 360 nm. The column temperature was 30 ℃ and the sample size was 10 μL.ResultsThe linear range of quercetin was 0.1505-0.9030 μg (r=0.9999), the average recovery was 99.86% (RSD=0.4%); the linear range of haempferol was 0.1450-0.8940 μg (r=0.9998), the average recovery was 99.79% (RSD=0.5%); the linear range of isorhamnetin was 0.0995-0.5970 μg (r=0.9998), the average recovery was 99.80% (RSD=0.3%).ConclusionsThe method is simple, accurate, and special and can be used for the quality control of folium ginkgo pellets capsules.

Folium ginkgo pellets capsules; Haempferol; Isorhamnetin; Quercetin; HPLC

R9

B

1671-8194（2014）29-0012-02

*通訊作者：E-mail：J-D-BO@163.com