HBeAg陽性慢性乙型肝炎外周血T淋巴細胞上CD28表達初步研究

齊青松++++++劉志華+++徐建明++++++鐘培星++++++章小東

[摘要] 目的 分析HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細胞CD28表達特點。 方法 采集健康人、HBeAg陽性乙肝病毒攜帶者、HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者的外周血，抗體標記，采用流式細胞技術檢測CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+CD28+T細胞、CD8+CD28+T淋巴細胞，同時檢測肝功能、HBVDNA。 結果 慢性乙型肝炎組、乙肝病毒攜帶組CD4+CD28+T細胞、CD8+CD28+T細胞、CD28+T細胞明顯低于健康對照組（P<0.05）；高病毒載量組（HBVDNA≥107組）CD8+CD28+T細胞低于低病毒載量組（HBVDNA<107組）（P<0.05）。結論 所有結果顯示乙型肝炎病毒持續感染狀態與CD8+T細胞上共刺激分子CD28的表達低下有關， 而CD8+T細胞上CD28的低表達與高病毒載量有關。

[關鍵詞] 乙型肝炎；T淋巴細胞；CD28

[中圖分類號] R512.6+2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）09-0018-04

HBV感染后的轉歸依賴于人體免疫狀態及其免疫應答，強有力的免疫反應針對病毒多種抗原產生特異性抗體最終清除病毒，而低下的免疫反應不僅不能控制病毒復制而且導致持續感染和疾病進展。CD8+T細胞作為主要效應細胞，在病毒清除中起重要作用[1，2]。而T細胞正常激活需要共刺激信號，CD28是T細胞上重要的共刺激分子，CD28對T細胞活化起關鍵作用[3]。盡管多種治療的實施包括抗病毒藥物的應用，最終能夠清除病毒的慢性乙型肝炎病例較少，因此筆者分析慢性乙型肝炎患者外周血CD28分子在T淋巴細胞表達情況、并將乙肝感染者與健康人群比較、探討乙肝感染慢性化的原因。

1 對象與方法

1.1研究對象

研究對象來自2012年7月～2013年8月廣東醫學院附屬東莞市厚街醫院傳染科門診及住院病區患者以及本院職工，從符合抗病毒標準[4]的HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者中，知情同意后，抽取22例患者準備接受抗病毒治療為A組，其中男13例，女9例，年齡21～45歲，平均（29.59±7.35）歲；另抽取21例HBeAg陽性慢性乙肝病毒攜帶者為B組，其中男13例，女8例，年齡20～45歲，平均（31.33±7.81）歲；本院HBsAg陰性的健康職工中抽取20例為C組，其中男12例，女8例，年齡21～42歲，平均（31.15±5.04）歲。排除標準：①6個月內使用過抗乙肝病毒、免疫抑制劑等藥物；②同時感染甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、HIV；③伴有其他系統嚴重疾病（惡性腫瘤、嚴重心臟病、糖尿病等）或免疫性疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑儀器 Anti-Human CD3 PE-Cy7、Anti-Human CD4 FITC、Anti-Human CD8 APC、Anti-Human CD28 PE購自美國ebioscience公司，BD-FACSCalibur II流式細胞分析儀。

1.2.2 細胞染色流式細胞儀檢測分析 EDTA抗凝管抽取靜脈3 mL，1500 rpm/min離心5 min后，3 mLD-Hanks液小心稀釋沉淀，再次1500 rpm/min離心20 min后，小心將白膜層細胞吸出。D-Hanks液洗滌一次后，加入Anti-Human CD3 PE-Cy7、Anti-Human CD4 FITC、Anti-Human CD8 APC、Anti-Human CD28 PE抗體室溫避光染色30min，然后2%小牛血清PBS洗滌2次后，BD-FACSCaliburⅡ流式細胞分析儀進行檢測并進行結果分析。

1.2.3 HBVDNA、肝功能、乙肝六項、甲丙丁戊肝抗體、HIV抗體檢測 HBV-DNA定量檢測采用ABI7000檢測儀，乙肝六項、甲丙丁戊肝抗體、HIV抗體檢測采用ELISA方法進行，肝功能使用貝克曼DXC800自動化分析儀。

1.3統計學處理

應用SPSS13.0軟件進行統計學分析，各組標準化的樣本數值用（x±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

所有檢測數值為各T細胞亞群占CD3+T細胞百分比計算，CD3+T細胞代表總T淋巴細胞。

2.1 三組T細胞亞群比較

將A組（慢性乙型肝炎組）、B組（乙肝病毒攜帶組）、C組（健康對照組）年齡進行比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2相關指標比較

A組、B組CD4+T細胞百分率、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值低于C組，差異有統計學意義（P<0.05），A組、B組CD8+T細胞百分率高于健康對照組，差異無統計學意義（P>0.05）；見表1。A組、B組CD28+T細胞、CD4+CD28+T細胞、CD8+CD28+T細胞百分率低于C組，差異有統計學意義（P<0.05），而A組、B組之間CD4+CD28+T細胞、CD8+CD28+T細胞百分率差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.3 不同病毒載量患者T細胞亞群比較

筆者按病毒載量HBVDNA≥107、HBVDNA<107分組比較，高拷貝組CD4+CD28+T細胞百分率低于低拷貝組，差異無統計學意義（P>0.05）；高拷貝組CD28+T細胞、CD8+CD28+T細胞百分率低于低拷貝組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.4 慢乙肝病人及健康人外周血T淋巴細胞亞群上CP28分子表達

以單個慢性乙型肝炎病人、乙肝攜帶者、健康人為例，采用流式細胞儀分析外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞亞群以及各亞群CD28分子表達情況。見圖1～3。

3 討論

乙肝病毒感染發病與清除機制尚未完全弄清，普遍認為與感染者免疫狀態有關，CD4+T細胞為輔助性T細胞，CD8+T細胞是清除病原體的主要效應細胞，其中CTL（cytotoxix T lymphocyte，細胞毒性T淋巴細胞）在控制感染及清除病原體過程中起著關鍵作用[5、6]，CD8+CD28+T細胞就是CTL。

T細胞功能正常是以活化為前提的，它的激活必須經過雙信號， 第一信號通過T細胞抗原受體識別并結合抗原遞呈細胞表面的MHC（major histocompatibility complex，主要組織相容性復合體）-抗原肽產生，第二信號通過T細胞上CD28與抗原遞呈細胞上的B7分子結合產生[7]。近10余年，許多新的共刺激通路和共刺激分子被發現，雙信號理論也得到不斷完善，傳統的CD28/B7通路仍然是最主要的共刺激通路，因此筆者對慢性乙型肝炎患者外周血T細胞上CD28表達情況進行研究。

本研究選取22例HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者和21例乙肝病毒攜帶者，并選擇20例本院健康職工為對照組，由于CD28表達隨著年齡的增長而逐步下調[8]，筆者對三組年齡進行比較，差異無統計學意義，因而具有可比性。研究結果顯示：①慢性乙型肝炎組、乙肝病毒攜帶組CD4+CD28+T細胞明顯低于健康對照組，差異有統計學意義，與Arasli[9]、范振平[10]報道一致。有研究表明，CD4+T細胞對CD8+T細胞的增殖與活化具有重要調節作用[11]，CD4+T細胞自身同樣需要活化，CD4+CD28+T細胞減少表明能被活化的CD4+T細胞減少，因而CD4+T細胞的調節作用受影響，必然在一定程度上影響到CD8+T細胞的增殖與活化。②慢性乙型肝炎組、乙肝病毒攜帶組CD8+CD28+T細胞低于健康對照組，差異有統計學意義，與范振平[10]、王沂芹[12]報道結果一致。因此，以上結果表明乙肝感染者CD4+CD28+T細胞、CD8+CD28+T細胞減少與乙肝感染持續狀態有相關性。③慢性乙型肝炎組、乙肝病毒攜帶組CD4+CD28+T細胞、CD8+CD28+T細胞之間差異無統計學意義。理論上，慢性乙型肝炎處于免疫激活狀態，乙肝病毒攜處于免疫耐受狀態，他們之間應該存在差異，本研究結果可能與樣本含量有關，需要擴大樣本量。不過，無論是慢性肝炎還是乙肝病毒攜帶者，最終能清除病毒的比例極少，顯示兩者免疫狀態沒有本質上的區別，可能是免疫耐受程度稍有差異。

另外，筆者將研究對象按照病毒載量高低分為HBVDNA≥107、HBVDNA<107兩組，結果病毒載量越高，CD8+CD28+T細胞百分率越低，而CD4+CD28+T細胞百分率并不受HBV病毒載量的影響，提示HBV高復制與CD8+T細胞的CD28分子的低表達有相關性。不過，并非只有HBV感染出現CD8+T細胞上CD28分子的表達低下，HIV、EBV等病毒[13、14]也出現同樣表現，結合目前實驗結果，筆者推測，HBV特異性CTL長期暴露在大量抗原刺激，可能導致CD8+CD28+T細胞消耗性減少，因而表現為乙肝感染者CD8+T細胞上CD28分子的表達下調。但是，最近有研究發現[15]慢性乙型肝炎患者外周血游離CD28較健康人增多，結合慢性乙型肝炎患者CD8+CD28+T細胞減少這一現象是否暗示著：CD8+CD28+T細胞減少另外一個原因可能是CD8+CD28+T細胞上CD28+分子與之解離導致？這還需要進一步論證。

[參考文獻]

[1] Thimme R， Wieland S， Steiger C，et al. CD8（+）T cells mediate viral clearance and disease pathogenesis during acute hepatitis Bvirus infection[J]. J Virol，2003，77（1）： 68-76.

[2] Tang TJ， Kwekkeboom J， Mancham S， et al. Intrahepatic CD8+ T-lymphocyte response is important for therapy-induced viral clearance in chronic hepatitis B infection[J]. J Hepatol，2005，43（1）：45-52.

[3] Acuto O， Michel F. CD28-mediated co-stimulation： a quantitative support for TCR signalling[J]. Nat Rev Immunol， 2003， 3（12）： 939-951.

[4] 中華醫學會肝病學分會.慢性乙型肝炎防治指南[J]. 中國臨床醫生，2012，40（4）：66-78.

[5] Chisari FV， Isogawa M，Wieland SF. Pathogenesis of hepatitis B virus infection[J]. Pathol Biol，2010，58（4）： 258-266.

[6] Messaoudi I， Guevara-Patino JA， Dyall R， et al. Direct link between MHC polymorphism， T cell avidity， and diversity in immune defense[J]. Science，2002，298（5599）：1797-1800.

[7] Sharpe AH. Mechanisms of costimulation[J]. Immunol Rev， 2009， 229（1）：5-11.

[8] Weng NP， Akbar AN， Goronzy J. CD28- T cells： their role in the age-associated decline of immune function[J]. Trends Immunol，2009，30（7）： 306-312.

[9] Arasli M，Ustundag Y，Delikanlib B，et al. Peripheral blood lymphocyte dynamics and viral kinetics in patients with chronic active hepatitis B virus infection treated by tenofovir[J]. Hepatogastroenterology， 2012， 59（115）：851-857.

[10] 范振平，張玲霞，楊斌，等. 乙型肝炎患者外周血T淋巴細胞亞群的特點和意義[J]. 世界華人消化雜志，2005， 13（2）：194-197.

[11] Khanolkar A，Fuller MJ，Zajac AJ. CD4+T cell-dependent CD8+T cell maturation[J]. J Immunol，2004，172（5）： 2834-2844.

[12] 王沂芹，柏健鷹，傅曉嵐，等. 慢性乙型肝炎患者HBV特異性CTL的CD28表達研究[J]. 第三軍醫大學學報，2006，28（4）：342-344.

[13] Paul ME，Shearer WT，Kozinetz CA， et al. Comparison of CD8（+） T-cell subsets in HIV-infected rapid progressor children versus non-rapid progressor children[J]. J Allergy Clin Immunol， 2001，108（2）：258-264.

[14] Catalina MD， Sullivan JL， Brody RM， et al. Phenotypic and functional heterogeneity of EBV epitope-specific CD8+ T cells[J]. J Immunol， 2002，168（8）：4184-4191.

[15] 彭文麗，畢小云.血清可溶性共刺激因子CTLA-4和CD28在乙型肝炎患者血清中的表達及意義[J]. 第三軍醫大學學報，2013，35（1）：82-84.

（收稿日期：2013-12-09）

[9] Arasli M，Ustundag Y，Delikanlib B，et al. Peripheral blood lymphocyte dynamics and viral kinetics in patients with chronic active hepatitis B virus infection treated by tenofovir[J]. Hepatogastroenterology， 2012， 59（115）：851-857.

[10] 范振平，張玲霞，楊斌，等. 乙型肝炎患者外周血T淋巴細胞亞群的特點和意義[J]. 世界華人消化雜志，2005， 13（2）：194-197.

[11] Khanolkar A，Fuller MJ，Zajac AJ. CD4+T cell-dependent CD8+T cell maturation[J]. J Immunol，2004，172（5）： 2834-2844.

[12] 王沂芹，柏健鷹，傅曉嵐，等. 慢性乙型肝炎患者HBV特異性CTL的CD28表達研究[J]. 第三軍醫大學學報，2006，28（4）：342-344.

[13] Paul ME，Shearer WT，Kozinetz CA， et al. Comparison of CD8（+） T-cell subsets in HIV-infected rapid progressor children versus non-rapid progressor children[J]. J Allergy Clin Immunol， 2001，108（2）：258-264.

[14] Catalina MD， Sullivan JL， Brody RM， et al. Phenotypic and functional heterogeneity of EBV epitope-specific CD8+ T cells[J]. J Immunol， 2002，168（8）：4184-4191.

[15] 彭文麗，畢小云.血清可溶性共刺激因子CTLA-4和CD28在乙型肝炎患者血清中的表達及意義[J]. 第三軍醫大學學報，2013，35（1）：82-84.

（收稿日期：2013-12-09）

[9] Arasli M，Ustundag Y，Delikanlib B，et al. Peripheral blood lymphocyte dynamics and viral kinetics in patients with chronic active hepatitis B virus infection treated by tenofovir[J]. Hepatogastroenterology， 2012， 59（115）：851-857.

[10] 范振平，張玲霞，楊斌，等. 乙型肝炎患者外周血T淋巴細胞亞群的特點和意義[J]. 世界華人消化雜志，2005， 13（2）：194-197.

[11] Khanolkar A，Fuller MJ，Zajac AJ. CD4+T cell-dependent CD8+T cell maturation[J]. J Immunol，2004，172（5）： 2834-2844.

[12] 王沂芹，柏健鷹，傅曉嵐，等. 慢性乙型肝炎患者HBV特異性CTL的CD28表達研究[J]. 第三軍醫大學學報，2006，28（4）：342-344.

[13] Paul ME，Shearer WT，Kozinetz CA， et al. Comparison of CD8（+） T-cell subsets in HIV-infected rapid progressor children versus non-rapid progressor children[J]. J Allergy Clin Immunol， 2001，108（2）：258-264.

[14] Catalina MD， Sullivan JL， Brody RM， et al. Phenotypic and functional heterogeneity of EBV epitope-specific CD8+ T cells[J]. J Immunol， 2002，168（8）：4184-4191.

[15] 彭文麗，畢小云.血清可溶性共刺激因子CTLA-4和CD28在乙型肝炎患者血清中的表達及意義[J]. 第三軍醫大學學報，2013，35（1）：82-84.

（收稿日期：2013-12-09）