有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病腎病大鼠降鈣素基因相關(guān)肽的影響研究

龔志剛，黃小華

有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病腎病大鼠降鈣素基因相關(guān)肽的影響研究

龔志剛1，黃小華2

目的：研究有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病腎?。―N）大鼠降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的影響。方法：鏈脈佐菌素（STZ）誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，隨機(jī)分為糖尿病組（D）、糖尿病運(yùn)動(dòng)組（D+E）、同時(shí)另設(shè)正常對(duì)照組（N），有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)10周后，測(cè)定空腹血糖 （FBG）、尿微量白蛋白（U-mAIb）、血漿和腎臟組織中內(nèi)皮素（ET）和CGRP含量。結(jié)果：糖尿病大鼠U-mAIb增加，ET升高，CGRP下降，運(yùn)動(dòng)干預(yù)10周后，D+E組DN大鼠U-mAIb較D組顯著降低，ET顯著下降，CGRP明顯升高。結(jié)論：有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠腎臟病變有一定的保護(hù)作用，其部分機(jī)制可能是通過上調(diào)CGRP含量而實(shí)現(xiàn)的。

有氧運(yùn)動(dòng)；糖尿病腎病；降鈣素基因相關(guān)肽；大鼠

降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）是一種主要分布于中樞神經(jīng)和外圍神經(jīng)、心血管、內(nèi)分泌和消化等的舒血管生物活性肽，與糖尿病腎?。―N）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且隨著DN病程發(fā)展，血漿CGRP水平有明顯改變[1]。本課題在前人研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)CGRP可能成為防治血漿DN的更為特異的新靶點(diǎn)，通過有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)，研究運(yùn)動(dòng)對(duì)DN大鼠CGRP的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，從而進(jìn)一步探討有氧運(yùn)動(dòng)防治DN的作用機(jī)理，并為全民科學(xué)健身提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠40只，2月齡左右，體質(zhì)量200～250 g，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。溫度23土1℃，自然光照。

1.1.2 儀器及試劑 GC-911γ放射免疫計(jì)數(shù)器（中國科技大學(xué)創(chuàng)新股份有限公司）、便攜式血糖儀（日本京都公司）、DNM-9602酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）、DSPT-202鼠類電動(dòng)跑臺(tái)（中國杭州段氏制作公司）、HH-8數(shù)字顯示恒溫水浴箱（常州國華儀器公司）、DT-1001電子天平（江蘇常州衡器廠）；鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司）、大鼠降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）試劑盒，尿微量白蛋白（U-mAIb）試劑盒，內(nèi)皮素（ET）試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物建模 將40只大鼠隨機(jī)選取10只作為正常對(duì)照組，剩余30只作為建造糖尿病大鼠模型。造模前大鼠先空腹12h后，一次性腹腔注射1％ STZ-檸檬酸鈉緩沖液（STZ量按35mg/kg體重量）。對(duì)照組腹腔注射等體積0.1mmol/L、pH4.0檸檬酸鈉緩沖液，72h后尾靜脈采血，用便攜式血糖儀測(cè)定空腹血糖，試紙條測(cè)定尿糖，若血糖值≥16.7mmol/l，尿糖為++～++++者，確定模型建立，納入本實(shí)驗(yàn)。除去造模失敗及死亡大鼠，將糖尿病鼠24只納入本實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組 將24只糖尿病鼠隨機(jī)分為：糖尿病安靜組（D 組12只），糖尿病運(yùn)動(dòng)組（D+E組12只）；另外正常的大鼠設(shè)為正常對(duì)照組（N組10只）。運(yùn)動(dòng)方案：糖尿病運(yùn)動(dòng)組大鼠在動(dòng)物跑臺(tái)上進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，每周5天，持續(xù)10周進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)。運(yùn)動(dòng)負(fù)荷參照Powers[2]標(biāo)準(zhǔn)略有改良：跑臺(tái)坡度自始至終都為0°，而跑臺(tái)速度采用遞增方式（第1 周以30m/min的速度運(yùn)動(dòng)30 min進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，第2周以40m/min的速度運(yùn)動(dòng)40min，第3 周以60m/min的速度運(yùn)動(dòng)60min，以后維持上述負(fù)荷訓(xùn)練至10周結(jié)束）。為了避免酮癥和維持糖尿病鼠的生存，D組和D+E組大鼠隔日腹腔注射長效胰島素2～4單位，使血糖波動(dòng)在25 mmol/L左右。

1.2.3 標(biāo)本采集 有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)10周后，各組大鼠禁食12h，用代謝籠收集24h尿測(cè)定尿白蛋白含量，大鼠經(jīng)乙醚麻醉后心臟取血。然后背部作縱形切口，取出右腎，去包膜后用電子天平稱取100mg右腎組織，放入5mlEP管中，用剪刀剪碎，按照1∶10的比例加入0.19％生理鹽水，用電動(dòng)勻漿器（10 000r/min）勻漿2～3次，再經(jīng)4℃離心（3 000r/min）15min，取上清-20℃保存待測(cè)。測(cè)試生化指標(biāo)如下： ①空腹血糖（FBG）采用便攜式血糖儀測(cè)定；②降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）用放免法測(cè)定。③ 內(nèi)皮素（ET）采用放免法測(cè)定；④尿微量白蛋白（U-mAIb）采用ELISA法測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié) 果

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)DN大鼠相關(guān)生化指標(biāo)的影響

各組測(cè)得FBG、U-mAIb和ET值，D組和D+E組都較N組顯著升高（P＜0.05），經(jīng)過10周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，D+E組較D組顯著下降（P＜0.05）；而血清CGRP值，D組和D+E組較N組顯著下降（P＜0.05），且D+E組較D組明顯升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠FBG、U-mAIb、ET和CGRP的變化（X±SD）Table 1.Effect of aerobic exercise on FBG, U-mAIb, ET and CGRP of each group rats

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)DN大鼠腎臟ET和CGRP的影響

表2 各組大鼠腎臟組織ET和CGRP的變化（X±SD）Table2. .Effect of aerobic exercise on ET and CGRP in kidney of each group rats

有氧運(yùn)動(dòng)組（D+E）腎臟組織CGRP 含量顯著高于D組（P＜0.05），但較N組低（P＜0.05）；而D+E組腎臟組織ET含量較D組顯著下降（P＜0.05），與N組相比略高，但無顯著差異（P＞0.05）。

3 分 析

糖尿病腎?。―N）是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，其基本病理特征為腎小球基底膜均勻肥厚伴有腎小球系膜細(xì)胞基質(zhì)增加，腎小球囊和腎小球系膜細(xì)胞呈結(jié)節(jié)性肥厚及滲透性增加，出現(xiàn)蛋白尿、高血壓、水腫、腎衰竭等變化，是糖尿病重要的死亡原因[1]。其發(fā)病機(jī)理包括：①高蛋白飲食加劇糖尿病腎病的惡化：糖尿病病人由于嚴(yán)格限制碳水化合物的攝入，而以高蛋白纖維食物供給為主，顧此失彼，致使蛋白分解產(chǎn)物及磷的負(fù)荷過度和積聚，進(jìn)而加劇了DN的病理損害。②高血糖：長期與過度的血糖增高，可致毛細(xì)血管通透性增加，血漿蛋白外滲，引起毛細(xì)血管基底膜損害，腎小球硬化和腎組織萎縮。③高血壓的影響：糖尿病病人由于脂質(zhì)代謝紊亂，動(dòng)脈粥樣硬化等諸多原因，合并高血壓者為數(shù)不少，這些病人中幾乎都可見到尿微量蛋白，表明腎損害普遍。現(xiàn)臨床上已認(rèn)定U-mAIb是DN診斷的標(biāo)準(zhǔn)之一[3]。CGRP 是1983年由Rosenfold等[4]發(fā)現(xiàn)的一種非腎上腺素能和非膽堿能神經(jīng)纖維分泌的生物活性多肽物質(zhì)。人和鼠的許多組織器官都有CGRP表達(dá)，但其主要分布于神經(jīng)和心血管系統(tǒng)，同時(shí)也證實(shí)腦血管、蛛網(wǎng)膜、下腔血管、大動(dòng)脈和大靜脈、腎臟、呼吸道、胃腸道、骨骼肌等處均有大量CGRP受體。[5]CGRP是目前已知的舒血管作用最強(qiáng)的物質(zhì)，其發(fā)揮生物學(xué)調(diào)節(jié)功能是通過與G蛋白藕聯(lián)的CGRP受體結(jié)合后，激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)CAMP升高，通過第二信使cAMP的中介作用而發(fā)揮生物活性。如：在腎臟中腎血管床存在著大量的CGRP受體，CGRP與這些受體結(jié)合后產(chǎn)生舒張血管的作用，同時(shí)還可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與修復(fù)[6]。同時(shí)，CGPR可使系膜細(xì)胞舒展，從而增加腎小球?yàn)V過面積和濾過率，對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。CGRP和U-mAIb的聯(lián)合檢測(cè)可能作為DN的監(jiān)控指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)過程中，糖尿病大鼠都出現(xiàn)了U-mAIb增加，CGRP下降，說明DN造模是成功的。DN體內(nèi)持續(xù)的高血糖可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使ET分泌增加，ET是迄今所知最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，其作用時(shí)間持久，不為H1受體及5-HT受體阻斷劑拮抗，可被異丙腎上腺素、心鈉素及降鈣素基因相關(guān)肽等激素抑制[7-8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，DN大鼠血液和腎臟組織中CGRP較正常大鼠都顯著下降（P＜0.05），而ET則相反顯著升高（P＜0.05）。

目前學(xué)者們已普遍認(rèn)為[9-10]，適量運(yùn)動(dòng)促進(jìn)CGRP的分泌，過量運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練引起CGRP含量下降，運(yùn)動(dòng)疲勞下降更明顯。其可能機(jī)制是：運(yùn)動(dòng)作為一種應(yīng)激源，促使CGRP生成增加，當(dāng)機(jī)體適應(yīng)運(yùn)動(dòng)刺激時(shí)，CGRP則下降，當(dāng)負(fù)荷及時(shí)間超過一定范圍時(shí)CGRP迅速下降。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，長期耐力運(yùn)動(dòng)后糖尿病大鼠血液和腎臟組織中CGRP 含量顯著增加，ET含量明顯減少，提示長期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)DN有明顯的改善作用，其部分原因可能是通過提升CGRP的作用，拮抗或抑制ET的釋放，使腎臟血管舒張，改善微循環(huán)，減少U-mAIb的排放；另外有氧鍛煉也在一定程度上顯著降低糖尿病大鼠血糖的濃度，改善長期的高血糖狀態(tài)，加快血流和組織器官血液的重新分配，增加CGRP與腎臟血管中CGRP受體結(jié)合能力，更大程度改善機(jī)體微循環(huán)，從而對(duì)DN具有積極的防治作用。

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Effects of Aerobic Exercise on Calcitonin Gene-related Peptide in DN Rats

GONG Zhi-gang1，HUANG Xiao-Hua2

Object: To investigate the effect of aerobic exercise on calcitonin gene-related peptide in diabetic nephropathy(DN) rats. Methods: STZ-induced diabetic rats were randomly divided into two groups: DN rats model group (D)，DN rats exercise intervene group(D+E)，in addition，normal rats for control group(N). All rats were fed for 10 weeks. The serum FBG, U-mAIb, ET and CGRP were measured. Results: compared with N group, The content of U-mAIb and ET in DN rats were significantly increased. The level of CGRP was markedly decreased; After the Exercise treatment，the serum CGRP, ET and U-mAIb changes of diabetic rats in the D+E group were improved. Conclusion: Aerobic exercise could meliorate early kidney hy-perdynamic abnormality in DN rats，possess protective effect on kidney of diabetic rat whose mechanism may be associated partly with a UP-regulation of the CGRP level.

Aerobic exercise; Diabetic nephropathy; Calcitonin gene-related peptide; Rats

1007―6891（2014）01―0033―03

G804.5

A

2013-06-18

江西師范大學(xué)青年成長基金（3926）。

1.江西師范大學(xué)體育學(xué)院，江西 南昌，330022；

2.湖州市南潯區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 湖州，313009。

1.College of P.E., Jiangxi Normal University, Jiangxi Nanchang, 330022, China;

2. Department of Medical Laboratory Science, Integrated Traditional and Western Medicine Hospital, Zhejiang Huzhou, 313009, China.