枸杞多糖通過抑制H2O2誘導的INS-1細胞凋亡促進胰島素分泌?

張學軍，尹長江△，楊坤寶, 張海峰，史華寧

(1.承德醫學院，河北 承德 067000；2.承德醫學院附屬醫院，河北 承德 067000)

本研究擬從體外建立糖尿病細胞模型，研究枸杞多糖對H2O2誘導的β細胞凋亡的影響，旨在為枸杞多糖應用于糖尿病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 枸杞多糖 由本實驗室從枸杞子中提取、分離、純化而得。枸杞子由寧夏鑫顥博達科技發展有限公司提供。提取純化流程為枸杞子粉碎→石油醚丙酮回流脫脂→水提多糖→乙醇沉淀→真空干燥→粗多糖→Sevag法脫蛋白→乙醇沉淀→真空干燥→總多糖。總多糖經纖維素DEAE-52和葡聚糖Sephadex G100柱洗脫后冷凍真空干燥后即得純品。經苯酚-硫酸法檢測，其多糖純度>90。

1.1.2 細胞株及培養 INS-1細胞購自中國協和醫科大學細胞中心。培養基為含10%胎牛血清及青霉素(100 U/L)、鏈霉素 (100 mg/L) 的5.5 mmol/L葡萄糖DMEM培養基，于37℃、5% CO2培養箱培養。

1.1.3 試劑與儀器 NAC(SIGAMA, USA)，DMEM高糖培養基(GIBCO, USA)，MTT檢測試劑盒(南京建成科技有限公司)，Annexin V-PI凋亡雙染試劑盒(碧云天生物技術公司)，RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(北京全式金生物科技有限公司)，胰島素放射免疫分析試劑盒(中國原子能科學研究院)，二氧化碳培養箱(FORMA,USA)，5084R型高速冷凍離心機(EPPENDORF, Germany)， 放射免疫計數儀(中佳合肥科技有限公司)，FACS Aria流式細胞儀(BD, USA)，Mx3000P熒光定量PCR儀(AGILENT, USA)，MK3酶標儀(THERMO LABSYSTEMS, USA)。

1.2 方法

1.2.1 分組與加藥處理 INS-1 細胞分為正常對照組、H2O2對照組、陽性藥物對照組(N-乙酰半胱氨酸，NAC)、枸杞多糖治療組(LBP)4組，每組6 孔。細胞處于對數生長期時，除正常對照組外，均給予終濃度為 100 μmol/l H2O2，陽性對照組同時給予NAC，終濃度為10 nmol/l，受試藥組同時給予枸杞多糖，終濃度為100 mg/l。

1.2.2 MTT法檢測細胞活力 INS-1 細胞以每孔106個/ml的密度接種于96孔板中，24 h后加藥處理，繼續培養 24 h，然后加入5 g/L 的 MTT 10 μL，孵育4 h 后加入DMSO 150 μL，使沉淀溶解，用酶聯免疫檢測儀于 570 nm 波長處測定其吸光度。

1.2.3 葡萄糖刺激胰島素分泌試驗(GSIS) INS-1細胞以每孔5×105個/ml的密度接種于6孔板中，培養24 h細胞貼壁后換液并加入各組所需藥物。培養24 h后PBS沖洗細胞，加入無糖KRBB緩沖液孵育30 min。然后再用含葡萄糖3和 30 mmol/l的 KRBB 緩沖液各孵育細胞1 h，分別收集上清液。采用放射免疫法檢測每組上清中胰島素含量。首先在100 μL待測樣品中加入100 μL抗血清(二抗)和100 μL分析試劑，混勻37℃孵育2 h后，加入100 μL125I-胰島素 37℃孵育1 h。然后加入第二抗體100 μL 37℃孵育30 min。反應完畢后，室溫 3000 r/min離心30 min，用γ計數儀測定沉淀物放射性強度，根據標準曲線計算樣品胰島素含量，同時采用BCA法測定每組蛋白總量。取不同濃度蛋白標準品繪制蛋白含量標準曲線，然后測量各待測樣品吸光度，計算蛋白含量。單位質量胰島素濃度=每孔胰島素含量/相應的細胞蛋白含量。

1.2.4 細胞凋亡檢測 INS-1細胞以每瓶105個/ml密度接種于25 cm2細胞瓶中，培養24 h細胞貼壁后換液并加入各組所需藥物。培養24 h后，胰酶消化制備單細胞懸液，調整密度為5×105～1×106個/ml。取1ml細胞用預冷的PBS離心清洗后，重懸于200 μL Binding Buffer。然后加入 10 μL Annexin V-FITC 和 10 μL PI輕輕混勻，避光室溫反應 15 min 后加入 300 μL Binding Buffer上機檢測。

1.2.5 細胞凋亡相關基因表達變化檢測 INS-1細胞按照1.2.3 所述接種加藥。培養24 h后提取細胞總mRNA，逆轉錄后 采用熒光定量試劑盒結合熒光定量PCR儀，以β-actin為比較檢測mRNA 表達變化。所需引物由上海生工生物工程有限公司設計合成。引物序列為：Bcl-2: 5’-TGCACCTGACGCCCTTCAC, 3’-ACAGCCAGGAGAAATCAAA, 292bp;Bax: 5’- CCAAGAAGCTGAGCGAGTGT, 3’-CAAAGATGGTCACGGTCTGC, 370bp;Caspase-3: 5’- TTTTTCAGAGGGGATCGTTG, 3’- AATTCTGTTGCCACCTTTCG, 315bp。Real-time RT-PCR擴增體系 (50 μl)：SYBRGreen Mix 31.5 μl，上游引物 1 μl，下游引物1 μl，cDNA模板2 μL，ddH2O 14.5 μl。Real-time RT-PCR反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，55±5℃ (Bcl-2: 54℃;Bax: 55℃;Caspase-3: 54℃) 退火30 s，72℃延伸30 s，擴增40個循環，每個循環后自動讀取熒光信號；溫度從65℃～95℃，每升高0.5℃讀取1次數據并做溶解曲線。各樣本設2個復管，實驗重復3次。按照2-ΔΔCt方法計算各組相對表達量，其中ΔCT=CT(目的基因)-CT(內參基因)(β-actin)，ΔΔCT=ΔCT(處理)-ΔCT(對照)。

1.3 統計學方法

采用SPASS 13.0統計軟件進行統計分析，計量數據以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用方差分析，各組與對照組比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 枸杞多糖對H2O2處理INS-1細胞活力和GSIS的影響

表1 枸杞多糖對INS-1細胞活力和GSIS的影響(±s)

表1 枸杞多糖對INS-1細胞活力和GSIS的影響(±s)

組別例數細胞活力基礎胰島素分泌(μIU/mg protein)葡萄糖刺激的胰島素分泌(μIU/mg protein)正常對照組60.783±0.0740.673±0.0910.917±0.104H2O2對照組60.564±0.081**0.479±0.197**0.549±0.117**LBP治療組60.736±0.095##0.611±0.124#0.820±0.142##NAC對照組60.745±0.0920.632±0.0850.841±0.108

注：與正常對照組比較：**P<0.01; 與H2O2對照組比較：#P<0.05,##P<0.01

表1顯示，100 μmol/l H2O2處理INS-1細胞24 h后，與正常對照組比較，H2O2對照組細胞活力明顯降低，基礎胰島素分泌和葡萄糖刺激的胰島素分泌都明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)；而LBP治療組與H2O2對照組比較，細胞活力比明顯增高(P<0.01)，基礎胰島素分泌和葡萄糖刺激的胰島素分泌明顯增多，且葡萄糖刺激的胰島素分泌比基礎胰島素分泌增加更為明顯(P<0.01vsP<0.05)，與NAC對照組比較差異無統計學意義。

2.2 枸杞多糖對H2O2處理INS-1細胞凋亡率及凋亡相關基因mRNA表達的影響

圖1、表2顯示，H2O2處理可引起INS-1細胞凋亡，其細胞凋亡率明顯高于正常對照組(P<0.01)；與H2O2對照組比較，LBP處理明顯減少INS-1細胞的凋亡(P<0.01)。

表2顯示，與正常對照組比較，H2O2對照組Bcl-2的表達水平明顯降低(P<0.01)，Bax和Caspase-3的表達水平明顯升高(P<0.01,P<0.01)。在LBP治療組中，Bcl-2的表達水平比H2O2對照組明顯升高(P<0.01)，Bax和Caspase-3的表達水平比H2O2對照組明顯降低(P<0.01,P<0.01)。此外，LBP治療組與NAC對照組比較差異無統計學意義。

圖1 INS-1細胞凋亡變化A. 正常對照組；B. H2O2對照組；C. 枸杞多糖治療組；D. NAC對照組

表2 枸杞多糖對H2O2處理INS-1細胞凋亡率及凋亡相關基因mRNA表達的影響

注：與正常對照組比較：**P<0.01; 與H2O2對照組比較：##P<0.01

3 討論

凋亡是胰島β細胞減少的主要原因[1]，由此導致的胰島素分泌減少是糖尿病發生發展的重要因素，因此研究胰島β細胞的凋亡及其機制對糖尿病的防治具有重要意義。

INS-1是大鼠胰島素瘤細胞系，具有胰島素分泌功能，廣泛應用于體外胰島β細胞的相關研究中。本研究采用常用的H2O2凋亡模型，結果顯示INS-1細胞活力和胰島素分泌能力均明顯降低，細胞凋亡也明顯增多，由此說明INS-1細胞凋亡模型造模成功。

消渴病主要涉及肺、脾、腎、肝四臟，以脾腎為本，即以氣陰為本。氣陰兩虛是消渴病最重要的病機。凋亡是在多種生理和病理條件下，細胞自主發生的一個程序性死亡過程。在細胞凋亡發生前期或早期，細胞內與凋亡相關的許多基因表達水平會發生變化，控制著細胞完成凋亡。Bcl-2和Bax是細胞內凋亡發生的2個關鍵調節因子，其中Bcl-2為抑凋亡因子，Bax為促凋亡因子，兩者表達水平的相對比值是判斷細胞凋亡或存活的重要指標。Caspase-3是位于Bcl-2與Bax下游的凋亡執行者，直接導致細胞凋亡。在本研究中，H2O2處理的INS-1細胞中Bcl-2 mRNA的表達明顯降低， Bax 和Caspase-3 mRNA的表達明顯升高，而LBP治療組中Bcl-2的 mRNA表達明顯升高，Bax 和Caspase-3 的mRNA表達明顯降低。表明LBP可通過促進Bcl-2的表達，同時抑制Bax 和Caspase-3的表達，降低H2O2誘導的INS-1凋亡。汪朝陽等[2]研究發現，枸杞多糖能顯著減少H2O2誘導氧化應激對大鼠晶狀體上皮細胞的損傷，減少細胞凋亡。INS-1細胞H2O2凋亡模型的建立也是以H2O2誘導氧化應激從而引發INS-1細胞凋亡為基礎，而LBP能顯著減少INS-1細胞凋亡，其可能與減少細胞氧化應激損傷有關。劉磊等[3]研究發現，枸杞多糖能夠促進胰島β細胞的密度，改善胰島細胞形態。本研究發現，LBP能顯著保護H2O2刺激下INS-1細胞的活力，減少細胞凋亡，從一定程度上增加了INS-1細胞密度。

此外，我們還研究了LBP對體外INS-1 細胞胰島素分泌功能的影響，結果發現，LBP對H2O2處理INS-1細胞的基礎胰島素分泌和葡萄糖刺激的胰島素分泌都有明顯的改善作用，尤以葡萄糖刺激的胰島素分泌改善最為明顯。蔡慧珍等[4]研究發現，枸杞多糖對小鼠胰島β-TC6細胞的胰島素分泌有促進作用，Zou等[5]報道枸杞多糖能刺激糖尿病小鼠胰島素的分泌，Huang等[6]研究發現枸杞多糖及其復方能使鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠空腹胰島素及β細胞功能指數升高。本研究結果與此也基本相同。

綜上所述，枸杞多糖可能通過促進Bcl-2的表達，同時抑制Bax 和Caspase-3的表達，以降低H2O2誘導的INS-1凋亡，促進INS-1細胞胰島素分泌。

參考文獻：

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[2] 汪朝陽, 黃秀榕, 祁明信, 等. 枸杞多糖對氧化損傷大鼠晶狀體上皮細胞凋亡的調控[J]. 眼視光學雜志, 2003, 5(2): 69-71.

[3] 劉磊，李青旺，趙蕊, 等．枸杞多糖對糖尿病小鼠胰島細胞形態與功能的影響[J]．黑龍江畜牧獸醫，2008(3): 93-94.

[4] 蔡慧珍, 劉康福, 孫桂菊. 枸杞多糖對β-TC6細胞胰島素分泌及相關基因的影響[J]. 江蘇醫藥, 2013, 39(4): 391-393.

[5] Zou S, Zhang X, Yao W, et al. Structure characterization and hypoglycemic activity of a polysaccharide isolated from the fruit ofLyciumbarbarumL[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 80(4): 1161-1167.

[6] Huang C, Chen QL, Sun JT, Yang WB, Ma LJ, Wan XD. Protective effect of lycium barbarum polysaccharide and its compound recipe on pancreatic islet function in rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus[J]. Chinese Journal of Clinical Rehabilitation, 2006, 10(23): 173-175.