經久不愈奶牛臨床型乳房炎病例的病原菌分離鑒定

楊　俊，吳　瓊，王九峰，劉光男（.中國農業大學動物醫學院，北京海淀0093；.內蒙古烏蘭察布市動物衛生監督所，內蒙古烏蘭察布0000）

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經久不愈奶牛臨床型乳房炎病例的病原菌分離鑒定

楊俊1，吳瓊1，王九峰1，劉光男2
（1.中國農業大學動物醫學院，北京海淀100193；2.內蒙古烏蘭察布市動物衛生監督所，內蒙古烏蘭察布012000）

摘要：為了研究全身及局部應用抗生素治療臨床型乳房炎后病原菌的構成及比例，本試驗對全身及局部灌注治療后仍未痊愈的奶牛進行基本信息匯總并對乳樣中病原菌進行形態學分離鑒定及16S rDNA基因序列分析。結果表明，經過治療仍可分離到大量大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及綠膿假單胞菌等易產生耐藥性的細菌。本試驗為臨床上經久不愈的乳房炎病例的治療提供了參考方法。

關鍵詞：奶牛乳房炎；病原菌；分離鑒定；16S rDNA

本研究對2015年4月北京市某奶牛場的患臨床型乳房炎的奶牛經過全身應用抗生素后經久不愈病例奶樣的病原菌的分離與鑒定，了解治療效果不佳病牛的病原菌分離情況，為尋找更好的治療經久不愈乳房炎病例及控制奶牛乳房炎的發展提供依據。

1　試驗試劑與設備

1.1主要試劑血平板、7.5%甘露醇氯化鈉瓊脂、伊紅美蘭（EMB）瓊脂、S.S.瓊脂及葡萄球菌生化鑒定管，購自北京奧博星生物技術責任有限公司，厭氧袋，購自日本三菱化學株式會社；PCR體系，購自北京博邁德基因技術有限公司。

1.2主要儀器與設備TCYQ型恒溫振蕩培養箱，購自太倉市實驗設備廠；SW-CJ-1FD型單人單面垂直凈化工作臺，購自蘇州智凈凈化設備有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養箱，購自上海一恒科學儀器有限公司；Model#：99 02型PCR儀，購自美國ABI公司；DYY-6C型電泳儀，購自北京市六一儀器廠；凝膠成像儀，購自美國Alpha Innotech公司；立式高壓蒸汽滅菌器YXQ-LS-50SⅡ，購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

2　材料與方法

2.1試驗材料采自北京市某奶牛場9頭患臨床型乳房炎并經過全身及局部用藥仍未痊愈的荷斯坦泌乳牛9個乳區乳樣，并取3個健康乳區乳樣進行對照試驗。首先乳區消毒后，棄去前3把奶，每個乳區采30～40 mL盛于經過高壓滅菌的離心管中并作好標記，置于冰盒，盡快送往實驗室并進行后續試驗。

2.2試驗方法（1）將乳樣涂于血平板：先取乳樣劃線接種于血平板上，另用厭氧袋做一份厭氧培養，37℃培養箱培養48 h；（2）將乳樣同時接種于選擇性培養基：7.5%甘露醇氯化鈉瓊脂、EMB、S.S.瓊脂選擇性培養基，24 h后觀察在各個培養基上的結果，統計常見細菌在各乳區的分布情況；（3）取（1）中特異性菌落，及選擇性培養基中非特異菌落溶解于生理鹽水中進行16S rDNA通用引物PCR后，測序，根據測序結果對細菌進行生化試驗。上游引物序列[1]：5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′，下游引物序列：5′-TAC GGY?TAC CTT GTT ACG ACT T-3′，目的條帶1 465 bp。

3　結果

3.1取樣奶牛及乳區信息由表1可知，在患病的9個乳區中處于圍產期的有2個（22%），泌乳早期的有3個（33%），中期的有3個（33%），后期有1個（11%），9頭患病牛中只有2個體溫高于正常，泌乳量除編號5外均明顯降低。

表1　取樣奶牛及乳區基本信息

3.2細菌分離結果由表2可知，綜合7.5%甘露醇氯化鈉瓊脂、EMB、S.S.瓊脂選擇性培養基結果、單菌落16S PCR、葡萄球菌屬細菌生化試驗結果，從12份乳樣中共分離出16種，27株細菌。其中葡萄球菌屬細菌最多，共有16株，共覆蓋9個乳區（75%），其中占發病的9個乳區中7個（78%），健康的3個乳區占2個（67%），其中又以表皮葡萄球菌最多，覆蓋了8個乳區，占了所有乳區的67%，乳房炎最常見的大腸桿菌與金黃色葡萄球菌覆蓋率分別為58%、33%。

表2　分離鑒定出的細菌種類及分離率

4　討論

雖然此次分離出多種細菌，但是由于目前很多細菌仍不能培養仍有可能漏檢部分致病菌，原因如下：細菌相互干擾；優勢菌對劣勢菌的抑制作用；一般根據固體培養基上細菌的大小、顏色以及形態判斷，因此若某些細菌有相似的形態特征容易漏檢；濃度低也是培養陰性的重要原因；還有可能是此病原體為目前條件下不可培養或此種細菌在該培養基下不能生長或該培養基缺少此種細菌生長所需物質，可以用多重PCR或高通量測序鑒別，以獲得更全面的信息[2]。乳房炎發病率與管理和養殖環境的好壞密切相關，但在一定的管理和養殖條件下乳房炎發病率又與年齡、胎次、泌乳期高度相關，由于此次樣本量較少，經久不愈乳房炎與年齡、泌乳期、胎次的關系并不具有統計學意義需在以后的試驗中考慮到這一點。據報道有2%～55%乳牛在泌乳階段發生乳房炎[3]。抗生素療法在泌乳期間對許多導致乳房炎的病原體治愈率比較低，特別是對于金黃色葡萄球菌，經常導致慢性和復發性感染[4]，本次試驗所用樣品均為抗生素長期誘導所致，全身療法（氨芐西林、四環素、頭孢噻呋等靜脈注射）配合林可霉素乳房灌注，但是治療效果不佳，因此有必要將本次試驗所得菌株進行后續試驗以為開辟用于治療導致久治不愈乳房炎細菌的新途徑。國內外很多研究者已經將目光投向了抗生素的替代品，已知乳酸桿菌對一些感染有保護作用。這種能力與上皮細胞的粘附性能有關，通過特定的競爭或位阻抑制病原體粘附，以及分泌細菌素、H2O2、或其他抗菌復合物，競爭營養物質和

調節宿主免疫應答來抑制病原體的生長[5]，因此乳酸桿菌在乳房炎的治療上有望替代抗生素。據（Damien S. Bouchard等）報道，他們通過探究乳酸桿菌菌液中到底是細菌、培養液、乳酸、pH值、蛋白是哪種成分對金黃色葡萄球菌粘附及侵襲造成的影響，得出只有與活的乳酸桿菌接觸才能抑制金黃色葡萄球菌的侵襲，加熱滅活的乳酸桿菌只能抑制金黃色葡萄球菌的粘附的結論[9]。細菌入侵乳腺上皮細胞是細菌導致乳房炎的重要機制，因此有人試圖通過抑制細菌的內化作用來治療及預防乳房炎，其中研究抑制金黃色葡萄球菌的內化比較多，目前已經發現丁酸鈉、杜鵑素、麝香草酚、短鏈脂肪酸（丙酸和丁酸），乳酸桿菌還有VD3都能抑制金黃色葡萄球菌內化入乳腺上皮細胞及調節抗菌肽基因的表達[6-7]。

大腸桿菌、克雷伯氏菌、乳房鏈球菌是導致乳房炎最常見細菌，其次是化膿隱秘桿菌、停乳鏈球菌，再次為金黃色葡萄球菌[8]，在健康或亞臨床乳樣中，厭氧菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌所占比例明顯低于臨床型乳房炎[9]。此次細菌分離結果表明，經過上述治療像鏈球菌、克雷伯氏菌等乳房炎常見的病原菌均未分離到，余下的是葡萄球菌屬、大腸桿菌、綠膿假單胞菌等易產生耐藥性的細菌，這可能是抗生素選擇的結果，可以進行藥物敏感試驗后進行聯合用藥治療。據Georgios Oikonomou[9]等報道，健康乳汁與乳房炎乳汁中細菌種類均很多，其研究結果表明，健康乳樣中不含有大腸桿菌與克雷伯氏菌，這與本次試驗結果相悖，在10號乳區中分離到了大腸桿菌，這可能是由于僅憑臨床癥狀判斷乳房炎的有無，沒有采用SCC、CMT等方法檢測是否患有隱性乳房炎，因此以后的檢測需輔助SCC等指標。

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Isolation and identification of main pathogenic bacteria causing prolonged unhealed bovineclinical mastitis

YANG Jun1，WU Qiong1，WANG Jiu-feng1，LIU Guang-nan2
（1.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.Inner Mongolia Wulanchabu City Animal Health Inspection，Wulanchabu 012000，China）

Abstract：The aim of the present study is to detect the composition and proportion of pathogenic bacteria in milk samples from prolonged unhealed clinical mastitis cows after systemic and local application of antibiotics .We collected the basic informa?tion of the prolonged unhealed cows，and identified the pathogens through the colony morphology and 16S rDNA gene sequencing. The results showed that pathogenic bacteria（Escherichia coli，Staphylococcus aureus and Bacillus pyocyaneus）were resistant to an?tibiotics.This study provides an approach to treat prolonged unhealed clinical mastitis.

Key words：Bovine mastitis；Pathogenic bacteria；Identification；16S rDNA

中圖分類號：S858.23

文獻標志碼：A

文章編號：0529-6005（2016）05-0087-02

收稿日期：2016-01-29

基金項目：奶牛產業技術體系北京市創新團隊項目（BAIC0-62016）

作者簡介：楊俊（1990-），男，碩士生，從事臨床獸醫研究，E-mail：yang_jun1992@126.com

通訊作者：劉光男，E-mail：wsy4886061@163.com

Corresponding author：LIU Guang-nan