脂肪酶水解菜籽油腳料工藝條件的優化

楊欣　俆爾尼　胡冰彬

摘要 [目的]優化脂肪酶水解菜籽油腳料的工藝，提高菜籽油腳料水解率。[方法]以菜籽油腳料為原料，選用黑曲霉脂肪酶水解菜籽油腳料，通過單因素試驗、BoxBenhnken中心組合設計和響應面法對該脂肪酶水解油脂的工藝條件進行優化分析。[結果]單因素試驗得出，黑曲霉脂肪酶水解菜籽油腳料的最適酶添加量為200 U/ml，底物濃度75 mg/ml，酶解pH 7.0，酶解溫度40 ℃，酶解時間45 min以及搖床轉數150 r/min，此時菜籽油腳料水解率為16.4%。利用BoxBenhnken中心組合設計和響應面法確定了最優工藝條件是：酶添加量245 U/ml，底物濃度為75 mg/ml，酶解pH 7.0，酶解溫度是41 ℃，優化后的菜籽油腳料水解率達（26.92±0.86）%。[結論]研究可為菜籽油腳料的進一步開發利用提供參考依據。

關鍵詞 菜籽油腳料；黑曲霉脂肪酶；水解反應；水解率

中圖分類號 S509.9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）05-01526-04

Abstract [Objective] To optimize process conditions of hydrolysis from rapeseed oil sediment by lipase. [Method] With rapeseed oil sediment as raw material， through singlefactor experiment， BoxBenhnken compound design and response surface method， the technique conditions were optimized. [Result] The optimal condition are enzyme concentration 200 U/ml， substrate concentration 75 mg/ml， reaction systems pH 7.0， reaction temperature 40 ℃， reaction time 45 min and table of revolution 150 r/min， the hydrolysis of rapeseed oil sediment is 16.4%. On this base， the four major factors were optimized by using BoxBenhnken central composite orthogonal design and response surface methodology. The optimum conditions were determined as follows factors： enzyme concentration 245 U/ml， substrate concentration 75 mg/ml， pH 7.0， temperature 41 ℃， after optimization of rapeseed oil sediment to hydrolysis rate is （26.92±0.86）%. [Conclusion] The study can provide reference basis for further development and utilization of rapeseed oil sediment.

Key words Rapeseed oil sediment； Aspergillus niger lipase； Hydrolysis reaction； Hydrolysis rate

我國是世界上最大的油菜籽生產國，年產量早已突破1 000萬t，在菜籽油加工過程中，油腳料每年排放量高達20萬t。油腳料極易發酵變質、酸敗發臭，是我國城鎮油廠環境污染的重要源頭[1]。菜籽油腳料中含有25%～30%的中性油，25%～35%的磷脂[2]，其余為蛋白質、氨基酸、糖等碳水化合物，礦質元素及色素等物質。目前菜籽油腳料主要用來制備生物柴油、飼料、農業肥料等[3]，而從中提取不飽和脂肪酸、甘油、磷脂等，并進一步生產獲得附加值高的產品卻極為少見，所以油腳料的開發利用成為環境治理和生物資源再利用的重要研究課題。

脂肪酶能催化天然油脂的水解，生成脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯和甘油。其中的不飽和脂肪酸是人體必需的營養物質，具有重要的生理功能，不僅能促進身體發育和智力增長，還可調節血脂、提高免疫能力等[4]。菜籽油腳料中天然脂肪酸一般以甘油三酯形式存在，水解甘油三酯的主要方法有：硫酸法，操作過程復雜，脂肪酸質量不穩定[5]；堿皂化法，大量使用無機酸堿，殘留物影響產品質量，產生的大量廢液對環境造成污染；酶催化水解法，因高效、專一性強，反應條件溫和，不污染環境而逐漸成為當今研究的熱點之一[6]。

筆者通過黑曲霉脂肪酶對菜籽油腳料的水解作用，對黑曲霉脂肪酶[7-8]添加量、底物濃度、pH、溫度、時間以及搖床轉數等對水解菜籽油腳料的影響進行單因素優化，利用BoxBenhnken中心組合設計和響應面法對該酶的添加量、底物濃度、pH、溫度進行工藝參數的優化分析研究，以達到提高菜籽油腳料水解率的目的。

1 材料與方法

1.1 材料 菜籽油腳料（酸價38.15，皂化值182.64），來自江西南昌。主要試劑：黑曲霉脂肪酶（酶活≥12 000 U/g），Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。主要儀器：

THZC恒溫振蕩器，江蘇太倉市實驗設備廠；SK1快速混勻器，常州國華電器有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市英峪予華儀器廠；手提式壓力蒸汽滅菌器，上海華線醫用核子儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菜籽油腳料的乳化液制備。 因為菜籽油腳料不同于水，所以需要乳化劑來乳化菜籽油腳料形成水包油型（O/W），將底物均勻分散在反應體系中。按照菜籽油腳料∶乳化劑=1.2∶1.0[9]配制菜籽油腳料乳化液，按比例依次加吐溫80、司班80和菜籽油腳料于50 ml三角燒瓶中，放入水浴鍋75 ℃加熱10 min，然后在混勻器上混勻8 min，之后在混勻器上邊混勻邊加入蒸餾水，混勻8 min后，在水浴鍋中加熱10 min，這樣反復加熱混勻數次，至菜籽油與水充分混勻為止。再置121 ℃，30 min水解處理，備用。

1.2.2 脂肪酶水解菜籽油腳料的方法及水解率的測定。

因為脂肪酶水解菜籽油腳料反應為可逆反應，脂肪酶在酯水解和酯化反應中做催化劑用。一般在含百分之幾十水的反應體系中進行水解反應，若含水量控制在20%以內則優先進行酯化反應；反應混合物中含水量為70%～90%時，則脂肪酶進行的幾乎全為水解反應[10]。

取一定量的菜籽油腳料乳化液于150 ml的錐形瓶中，加入適量的黑曲霉脂肪酶，然后加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，置于搖床培養箱中，在一定溫度下，經一段時間酶解后，立刻加入50 ml醇醚混合溶液終止反應，用堿滴定法滴定，測得酸價，并做空白對照[11]。

1.2.3.5 酶解時間對酶水解油脂的影響。

取75 mg/ml的菜籽油乳化液3 ml于150 ml的錐形瓶中加入pH為7.0的緩沖液，加入黑曲霉脂肪酶200 U/ml， 40 ℃，100 r/min分別搖床0、30、45、60、120、240、360 min后，取出，加入50 ml醇醚混合溶液，用堿滴定法滴定，比較不同酶解時間對菜籽油腳料水解率的影響。

1.2.3.6 不同搖床轉數對酶水解油脂的影響。

取75 mg/ml的菜籽油乳化液3 ml于150 ml的錐形瓶中加入pH為7.0的緩沖液，加入黑曲霉脂肪酶為200 U/ml，40 ℃，分別在轉數為80、100、120、150、200 r/min搖床45 min后，取出，加入50 ml醇醚混合溶液，用堿滴定法滴定，比較不同振蕩轉數對酶促菜籽油腳料水解率的影響。

1.2.4 響應面法優化水解工藝。

根據各單因素試驗的結果，采用BoxBehnken設計數學模型[14]，選擇對黑曲霉脂肪酶水解菜籽油腳料有顯著影響的4個因素，即pH、溫度、底物濃度、酶添加量為自變量，以菜籽油腳料水解率為響應值，設計出4因素3水平的試驗設計方案，如表1。

3 結論

該試驗通過對黑曲霉脂肪酶水解菜籽油腳料的工藝條件進行研究，在單因素試驗的基礎上，通過Design expert 軟件BoxBenhnken試驗設計法對黑曲霉脂肪酶水解菜油腳料的酶添加量、底物濃度、pH、溫度做了進一步優化研究，確定了最優酶添加量是245 U/ml，底物濃度為75 mg/ml，pH 7.0，酶解溫度41 ℃。在此優化條件下，菜籽油腳料水解率為（26.92±0.86）%。

通過堿滴定法滴定酶水解菜油腳料體系中的游離脂肪酸，得出酸價；根據菜籽油腳料本身的酸價和皂化值，通過公式算出酶解菜油的水解率，但因為水解體系中含有緩沖液，且乳化液的顏色會干擾滴定終點的判斷，使得該方法重現性不夠理想，今后應該對該方法的反應體系進行探索，找出一種方法使得測定方法確定性高，重現性好。

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