人外周血內皮組細胞的培養與鑒定

付強　鄭昭芬　彭建強　何晉　王照飛

【摘要】 從外周血中分離單個核細胞（MNCs），種植在纖維連接蛋白（Fn）包被的六孔板，以EGM-2培養基定向誘導培養。培養第4天，全量換液后可見梭形或多角形貼壁細胞，鏡下可見多個呈“血島”樣生長的細胞集落，集落中間為聚集成簇的圓形細胞，周邊環繞放射狀梭形細胞。培養初始2周，梭形細胞首尾相連呈條索樣生長或兩排細胞平行排列呈管樣生長，并可見條索樣或管樣排列的細胞相互交錯成網。培養至第3周，細胞呈現為鋪路石樣外觀；經傳代后具有次級集落形成能力。流式細胞術顯示內皮組細胞（EPCs）表面標志物CD34，KDR呈陽性，而單核、巨噬細胞系表面標志物CD14無表達。激光共聚焦顯微鏡下，EPCs具有攝取Dil-acLDL和結合FITC-UEA-1的能力。

【關鍵詞】 單個核細胞；內皮祖細胞；細胞形態學；細胞表型

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2014.05.013 文章編號：1004-7484（2014）-05-2417-02

1 材料與方法

1.1 材料 淋巴細胞分離液購自天津灝洋，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素購自Hyclone，EGM-2購自Lonza，胰蛋白酶購自Amresco，人纖維連接蛋白（HFN）購自merck，DiI-acLDL購自Molecular probes，FITC-UEA-I、Galetin購自Sigma，PerCP/Cy5.5-KDR、PerCP/Cy5.5-IgG購自BioLegend，PE-CD34、PE-IgG、FITC-CD34、FITC-IgG購自Beckerman。外周學取自本課題組志愿者。

1.2 方法

1.2.1 密度梯度離心法分離人外周血MNCs及其誘導培養

1.2.1.1 采集人外周血25ml至含枸櫞酸鈉的50ml離心管 然后將抗凝血用PBS等倍稀釋；將稀釋后的抗凝血與人淋巴細胞分離液按1：1的比例沿離心管壁緩慢置于淋巴細胞分離液上，4℃、400g離心30min；離心后分為4層：上層為血漿、血小板和PBS，中層為淋巴細胞分離液，底層為紅細胞和粒細胞，中層與上層交界呈混濁的白膜層為MNCs層；用移液槍吸取MNCs層收集于新的50ml離心管中，用適量PBS洗滌兩遍；洗滌條件為：4℃、250g離心10min。

1.2.1.2 接種前預先將6孔板用50ug/mlFn包被24小時（5μg/cm2），接種時吸棄Fn，用PBS洗滌2次；用EGM-2誘導培養液（含10%FBS和100U/ml青鏈霉素）重懸MNCs；用EGM-2誘導培養液調整其濃度至5×106個/mL，接種至6孔板中，每孔加2mL，置于37℃，5%CO2，濕度大于95%下培養；4天后首次更換培養液繼續培養，以后根據營養狀況每周換液2-3次，相差顯微鏡下觀察內皮祖細胞的形態特征。

1.2.1.3 待細胞融合約80%時 棄盡舊培養液，用2mlPBS洗滌2次，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA200μL消化約1min，倒置顯微鏡下觀察，若細胞胞質回縮、細胞間隙增寬、細胞變圓，立即用EGM-2培養液2mL終止消化，輕柔吹打混勻細胞；吸取細胞懸液置入15mL離心管中，用PBS稀釋至15mL，4℃下100g離心5min，洗滌后加入EGM-2培養液重懸細胞；細胞計數后以1×104/cm2的接種密度進行傳代，根據營養狀況每周換液2-3次。

1.2.2 人外周血EPCs的鑒定

1.2.2.1 EPCs表型流式細胞術鑒定 第二代細胞培養至約80%融合時消化至加入1mlPBS的EP管中，250g離心5min洗滌細胞；用PBS重懸細胞，調整細胞濃度為1.0×107/ml，取100ul細胞混懸液置于編號（A，a-C，c）的EP管中；A-C管中分別加入下述直標抗體10ul：鼠抗人PE-CD34、鼠抗人PerCP/Cy5.5-KDR、鼠抗人FITC-CD14，同型對照a-c管中加入等量各自熒光標記的鼠IgG，室溫避光孵育1h；孵育完畢后各管加入PBS500u1，250g，離心5min，用500u1PBS重懸、混勻后，AccuriC6流式細胞儀檢測。

1.2.2.2 EPCs攝取Dil-acLDL和結合FITC-UEA-1的功能鑒定 細胞接種前將圓形蓋玻片浸于含200μlGaletin的24孔板中，孵育過夜；次日吸棄Galetin，消化第二代細胞，傳代接種至24孔板中蓋玻片上，根據營養狀況及時更換培養基；待細胞融合約50%時吸棄培養基，PBS漂洗3次，避光加入含Di1-ac-LDL（10ug/mL）的培養液200ul，置于37℃，5%C02，95%濕度下孵育4小時；孵育完畢吸棄培養液，PBS漂洗3次，加入4%多聚甲醛固定30min；吸棄4%多聚甲醛，PBS漂洗3次，避光加入FITC-UEA-1（10ug/mL）200ul，置于37℃，5%C02，95%濕度下1小時。滴少量Fluorescence Mounting Medium于載玻片上，用鑷子小心將蓋玻片夾出，PBS浸洗3次，吹干后覆蓋于載玻片上，激光共聚焦顯微鏡觀察，拍照。

2 結果

2.1 EPCs形態學特征 外周血MNCs誘導培養第4天，全量換液后可見梭形或多角形貼壁細胞（圖1A），鏡下可見多個呈“血島”樣生長的細胞集落，集落中間為聚集成簇的圓形細胞，周邊環繞放射狀梭形細胞（圖1B）。誘導培養初始2周，梭形細胞形態逐漸變細長，數量逐漸減少，未表現出明顯的增殖能力，期間可見細胞首尾相連呈條索樣生長或兩排細胞平行排列呈管樣生長，并可見條索樣或管樣排列的細胞相互交錯成網（圖1C）。誘導培養至第3周，細胞呈現為鋪路石樣外觀；經傳代后橢圓形細胞具有次級集落形成能力（圖1D）；傳代后細胞增殖迅速，3-4天細胞即融合成片。

2.2 EPCs的鑒定

2.2.1 EPCs表型流式細胞術鑒定 流式細胞術檢測EPCs的表面標志，結果顯示CD34，KDR呈陽性，而CD14無表達。

2.2.2 EPCs攝取Dil-acLDL和結合FITC-UEA-1的功能鑒定 激光共聚焦顯微鏡下，EPCs胞吞Dil-ac-LDL入胞漿，可見圍繞胞核呈紅色熒光的內吞泡；胞膜結合FITC-UEA-1，呈現為綠色熒光，并胞吞入胞漿與攝取的Dil-ac-LDL共同呈現為黃色熒光。

3 討論

分析認為這些單核巨噬系細胞促進血管新生的機制在于其旁分泌功能，即通過分泌促血管生成的細胞因子刺激EPCs成血管。因此也被稱為循環促成血管細胞（circulating angiogenic cells，CACs）。由此可見，不論是貼壁還是非貼壁細胞，經這些方法誘導培養后，都具有內皮細胞的一些特征，并參與血管新生，但卻不直接形成新生血管。

我們將外周血MNCs誘導培養第4天后可見梭形或多角形貼壁細胞（圖1A），鏡下可見多個呈“血島”樣生長的細胞集落，集落中間為聚集成簇的圓形細胞，周邊環繞放射狀梭形細胞（圖1B）。表現出早期EPCs的形態特征。本研究誘導培養第3周，成功獲得了鋪路石樣細胞；經傳代后具有次級集落形成能力（圖1D）；該細胞增殖迅速，3-4天細胞即融合成片，表現為晚期EPCs的形態特征。隨后我們采用流式細胞術檢測了細胞的表面標志，結果顯示內皮細胞表面標志物CD34，KDR呈陽性，而單核、巨噬細胞系表面標志物CD14無表達（圖2）；與上文所述的晚期EPCs特征相符。最后，本實驗進一步從功能學角度鑒定了誘導培養的細胞，說明該細胞具有內皮功能。

參考文獻

[1] 高冬，林薇，鄭良樸，林久茂，陳旭征，宋軍，陳可冀.血府逐瘀湯動員大鼠骨髓內皮祖細胞的實驗研究[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2007，（09）.

[2] 許遵鵬，廖燦，陳勁松，劉斌，吳韶清，辜少玲.流式細胞術分析凍存前后臍血CD34-+細胞的分布[J].臨床血液學雜志，2003，（06）.