紙片法快速檢測水中總大腸菌群方法探討

張振春

【摘要】目的：研究紙片法快速檢測水中總大腸菌群方法。方法：將采集到的水樣，按GB/T5750.12-2006《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》中多管發酵法和水中總大腸菌群紙片法同時測定水中總大腸菌群。結果：總大腸菌群紙片法快速檢測結果與國標多管發酵法測定結果比較無顯著性差異，兩種方法具有較好的相關性，相關系數為0.9670。結論：總大腸菌群紙片法與國標法相比無顯著性差異，具有一定的可行性，值得推廣。

【關鍵詞】總大腸菌群；紙片法；快速檢測；多管發酵法

Abstract：objective: to study the paper method of rapid detection method of total coliform bacteria in water. Methods: water samples were collected, according to GB/T5750.12-2006 "standard of drinking water test method of microbial indicators of multi-tube fermentation and total coliform bacteria in water paper method of determination of total coliform bacteria in water at the same time. Results: the total coliforms paper method Rapid test results compared with the national standard determination of multi-tube fermentation, there was no significant difference of two methods has good correlation, the correlation coefficient of 0.9670. Conclusion: the total coliforms paper method to there was no significant difference compared with national standard method, it has certain feasibility, is worth promoting.

Key words：total coliform bacteria; Pieces of paper; Rapid detection; Multiple tube fermentation

【中圖分類號】R4【文獻標識碼】A【文章編號】1671-8801（2014）08-0024-02

總大腸菌群是評價水中糞便污染程度的一個重要指標，目前國家標準方法GB/T5750.12-2006中（1）多管發酵法（2）濾膜法（3）酶底物法，大多數主要采用多管發酵方法，其具有準確性好、可靠性高、靈敏性好等特點，但是需要做大量的實驗準備工作且需要較長的時間才能獲得檢測結果，試驗操作繁瑣，需要進行初發酵，平板分離培養，染色鏡檢和復發酵等試驗步驟，不適用于對樣品進行快速檢測。因此研究水中總大腸菌群快速檢測方法是十分必要的。

紙片法是采用中國疾病預防控制中心營養與食品安全所監制，保定市康達醫學用品研究所研制的大腸菌群快速檢驗紙片，具有操作簡單，可直接加入樣品，在16-18小時內可獲得檢測結果等優點，特別適合工作量大，及衛生監督工作的需要。

1 材料與方法

1.1樣品

實驗樣品來自遼寧省沈陽市康平縣農村安全飲水工程中的水源井。

1.2試劑

多管發酵法：乳糖蛋白胨培養基和伊紅美藍培養基均來自杭州天和微生物試劑有限公司，革蘭氏染液試劑來自杭州天和微生物試劑有限公司。

紙片法：紙片是來自保定市康達醫學用品研究所。

1.3儀器

多管發酵法：試管、發酵管、500mL滅菌玻璃廣口瓶、滅菌平皿、天平、CX31OLYMPUS顯微鏡(日本株式會社生產)、BSC-1360ⅡA2生物安全柜（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）、LMQ.J高壓蒸汽滅菌器（山東新華醫療器械廠生產）、滅菌吸管、滅菌吸管、載玻片、接種環和DHP-420S恒溫培養箱（北京永光明醫療儀器廠）。

紙片法：試管、BSC-1360ⅡA2生物安全柜（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）、LMQ.J高壓蒸汽滅菌器（山東新華醫療器械廠生產）、滅菌吸管、DHP-9162

恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）。

1.4采樣方法

用500mL滅菌玻璃瓶取水樣封口編號送實驗室檢測。

1.5檢測方法

1.5.1多管發酵法（國標法）：按GB/T5750.12-2006中 2.1.5具體操作步驟如下：

（1）乳糖發酵試驗:取10mL水樣接種到10mL雙料乳糖蛋白胨培養液中，取1mL水樣接種到10mL單料乳糖蛋白胨培養液中，另取1mL水樣注入到9滅菌生理鹽水中，混勻后吸取1mL注入到10mL單料乳糖蛋白胨培養液中，每一稀釋度接種5管。將接種管置36℃培養箱內，培養24小時，如所有乳糖蛋白胨培養管都不產氣產酸則可報告為總大腸菌群陰性，如有產酸產氣者，則按下列步驟進行。

（2）分離培養：將產酸產氣的發酵管分別接種在伊紅美藍瓊脂平板上，于36℃培養箱內培養24小時，觀察菌落形態，挑取符合下列特征的菌落作革蘭氏染色、鏡檢和證實試驗。

深紫黑色、具有金屬光澤的菌落；

紫黑色、不帶或略帶金屬光澤的菌落；

淡紫紅色、中心較深的菌落。

（3）證實試驗：經上述染色鏡檢為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，同時接種乳糖蛋白胨培養液，置36℃培養箱中培養24小時，有產酸產氣者，即證實有總大腸菌群存在。

根據證實為總大腸菌群陽性的管數，查MPN檢索表，報告每100mL水樣中的總大腸菌群最可能數（MPN）值。如所有乳糖發酵管均陰性時，可報告總大腸菌群未檢出。

1.5.2紙片法：

5袋大紙片每袋用無菌吸管各接種水樣10mL；10袋小紙片其中5袋接種水樣各1mL,另5袋接種1：10水樣稀釋液各1mL,總接種量為55.5mL。將接種好的紙片置于37℃恒溫培養箱16-18小時取出觀察結果。紙片保持藍紫色不變或在藍紫色背景上呈現紅色菌落但紅色菌落周圍無黃暈為大腸菌群陰性紙片，紙片出現紅色菌落其周圍有黃暈或黃色背景下呈現紅色菌落或片狀紅暈為大腸菌群陽性。記錄陽性紙片袋數根據大腸菌群MPN檢索表報告。

2 結果

表1 多管發酵法和紙片法檢測結果（MPN/100mL）

樣品編號 多管發酵法 紙片法 樣品編號 多管發酵法 紙片法

100 1100

245 1222

300 1368

4 19 17 14 12 10

5 11 13 1522

6 221644

7 441767

8 25 29 189 11

9 17 17 197 6

1000209 9

計算統計值t=0.154，查t0.05=2.021，t

為了進一步研究兩種方法的相關性，將表1中的兩種方法測定結果做圖，以紙片法測定結果為縱坐標，以多管發酵法測定結果為橫坐標，如圖1所示。從圖1中可見兩種方法測定結果呈線性相關，相關系數為0.9670。

圖1 多管發酵法和紙片法測定結果相關性分析

3 討論

水中總大腸菌群檢測數據表明：紙片法快速檢測結果在多管發酵法檢測的結果的±10%之內波動，經t檢驗兩種方法沒有顯著性差異。兩種方法有較好的相關性，相關系數為0.9670，這表明總大腸菌群快速檢測法應用于水中總大腸菌群的測定具有一定的可行性。

總大腸菌群快速檢測法相對于傳統的多管發酵法具有明顯優點:方法簡單易懂，工作人員不需要特殊培訓；操作過程簡便易學，不需要太多的儀器；檢測時間短，無需確認試驗，能夠較快捷、準確地檢測水中總大腸菌群。

參考文獻：

[1]GB/T5750.12-2006. 生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標。